[发明专利]一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法。

背景技术

作物产量性状与植株器官大小存在密切关系，植物器官大小除受光照、温度、营养和激素等外境环境条件影响外，主要受基因表达和信号转导等遗传因子调控，研究认为，细胞总数目的增加和单细胞体积增大两个连续并相关的过程控制植物器官的大小，而植物器官大小在不同物种中差异显著但在物种内个体之间却相对一致，说明器官发育过程中，细胞分裂受到遗传物质的严格控制。

前人已经克隆和研究了许多控制植物器官大小的相关基因，如ANT、ARF2、ARGOS、AtTOR、AtEBP1、BB和KLUH等，其中，ARGOS基因在拟南芥、水稻、玉米、大白菜、萝卜、紫花苜蓿中通过调控细胞数目或细胞体积来调节植物器官大小。2003年，在拟南芥中首次发现了ARGOS基因，该基因受生长素上调表达并通过“auxin→AXR1基因→ARGOS基因→ANT基因”信号通路实现细胞增殖和器官生长的调节；水稻OsARGOS基因也受生长素诱导上调表达，转基因植株侧生器官的花和叶片变大，角果数目和种子数量增多；玉米ZmARGOS受乙烯下调表达并参与器官大小的调控，拟南芥转基因植株抗旱性提高，ZmARGOS8基因超表达，转ZmARGOS8基因玉米产量大幅提高。目前，谷子ARGOS基因及其启动子研究尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法。用同源克隆方法获得了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，用生物信息学方法分析了SiARGOS基因蛋白序列和启动子的顺式作用元件，采用荧光定量PCR方法分析了SiARGOS基因在谷子杂种中的表达差异，还对该基因编码区及其启动子序列进行了SNP和单倍型分析，同时开发了3个SiARGOS基因功能标记。

其具体技术方案为：

一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，包括以下步骤：

通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件Primer Premier5.O设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos-1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos-1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列。PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GC Buffer 10μL，10mmol/L dNTPs 0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL。PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测。

根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸约2kb，用软件Primer Premier5.0设计启动子区PCR引物Argos-Pro，引物序列为：Argos-Pro-F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos-Pro-R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件(除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min)同上，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列。将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。

一种SiARGOS基因的表达分析方法，包括以下步骤：

蛋白比对采用DNAMAN软件，同源进化分析采用MEGA5生成无根进化树，进化树生成采用邻接法。