[发明专利]一种广州管圆线虫体外培养基和体外培养方法

说明书

本发明提供一种广州管圆线虫体外培养基，包括虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基，这些培养基中均含有两性霉素B；通过在广州管圆线虫培养中加入两性霉素，可防止体外培养广州管圆线虫的污染，通过将已感染广州管圆线虫60d的大鼠进行解剖处理，挑出血管内的成虫，将成虫清洗后放入虫卵培养基中孵育，孵育一段时间后，挑出成虫，剩余的虫卵置于培养箱中培养7～10d，80%的虫卵可成功发育为I期幼虫，且体外培育的I期幼虫，III期幼虫，IV期幼虫，V期幼虫均可在体外长期存活，本发明的研究为广州管圆线虫的体外研究和应用提供了有效的技术保障。

技术领域

本发明涉及虫体培养技术领域，更具体地，涉及一种广州管圆线虫体外培养基和体外培养方法。

背景技术

线虫是地球上最为丰富的物种之一，广泛分布于自然界中，其中寄生于人体并导致疾病的寄生线虫有60余种。寄生线虫具有复杂的生活史，既可以引起各种复杂的疾病，也是研究病原体致病基因或病原体-宿主相互关系的理想模型，但是线虫的寄生特性和复杂的生活史，使得相关的研究工作进展缓慢。

建立一种寄生线虫体外培养的体系和方法，可以实现在体外条件下培养寄生线虫，有助于运用现代的基因编辑技术进行寄生虫的功能基因研究，探讨其致病机制，为抗寄生虫药物的开发提供条件和基础。

广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）是一种可引起嗜酸性粒细胞增多性脑脊髓膜炎的寄生线虫。该疾病主要流行于东南亚地区、太平洋岛屿，我国主要在台湾、广东、浙江和黑龙江等地，若误食感染广州管圆线虫的生或半生的螺类，感染期幼虫（III期）经消化道侵入体内后，随血液循环移行并侵入脑组织，从而引发该疾病。广州管圆线虫终宿主是大鼠，寄生在鼠肺动脉。成熟雌虫产卵，卵在肺动脉内孵出幼虫（I期幼虫），I期幼虫穿过肺泡并进入支气管，最后入消化道，随粪便排出体外。当鼠粪被淡水螺或陆生螺吞食后，I期幼虫可在螺体内发育，经过2 次蜕皮，发育到III期幼虫（感染期）；当大鼠吞食含有III期幼虫的螺后，幼虫在消化道内穿过肠壁、侵入鼠体。人不是广州管圆线虫的适宜宿主，侵入脑内的感染期幼虫不能发育成熟，但可引起脑组织炎症反应。小鼠也是非适宜宿主，因此，小鼠是广州管圆线虫病研究的常用实验动物。本专利申请人采用中间宿主藁杆双脐螺和终宿主大鼠，在实验室建立了广州管圆线虫的生活史，并在此基础上建立了一种虫卵和各期幼虫体外培养方法，明确了虫体培养的相关试剂和培养条件，从而实现了虫体从虫卵发育到I期幼虫，以及各期幼虫在体外的培养。本发明提供了一种简单和高效的广州管圆线虫体外培养技术和方法，为寄生线虫的新药筛选、功能基因和致病机制研究提供了有效的研究基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种广州管圆线虫体外培养基。

本发明的第二个目的是提供一种广州管圆线虫体外培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种广州管圆线虫体外培养基，所述培养基包括虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基，所述虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基中均含有两性霉素B。

优选地，所述两性霉素B分别在虫卵培养基、I期幼虫培养基、III期幼虫培养基、IV期幼虫培养基和V期幼虫培养基中的终浓度为0.5μg/mL。

优选地，所述虫卵培养基包含Ham’s F-12培养基和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。

优选地，所述I期幼虫培养基包含DMEM 基础培养基、胆固醇乙醇溶液、胎牛血清、螺组织提取液和复合抗生素，所述复合抗生素含有青霉素G钾、硫酸链霉素和两性霉素B。