[发明专利]新的猪圆环病毒及其共培养细胞株

说明书

本发明公开了一株新的猪圆环病毒突变株以及其共培养的猪肾细胞株，猪圆环病毒突变株感染细胞发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡。筛选的猪肾细胞株携带PCV2病毒，可稳定传代，大量产生病毒，制备的病毒可用于预防和治疗猪圆环病毒病。

技术领域

本发明属于细胞工程与病毒培养技术领域，具体地说，本发明涉及猪圆环病毒,及可与猪圆环病毒共培养的PK15细胞株，大量培养制备PCV2病毒的方法及应用。

背景技术

目前国内正在使用的猪圆环病毒疫苗主要有2种----亚单位苗和全病毒疫苗。亚单位苗虽安全性较好，但生产成本高昂，免疫期短。因此国内绝大部分猪场仍以全病毒疫苗为主。但全病毒疫苗生产亦有其技术瓶颈：（现有的）圆环病毒体外培养的细胞感染能力不高，感染速度慢，病毒在不同细胞个体中的复制速度差异极大，病毒培养效价很难在短时间内上升到理想状态，为解决该难题，所有生产者都在其培养工艺中增加一个用D-氨基葡萄糖处理，使细胞停留于细胞分裂的S期，以此保证病毒扩增的程序（严伟东《猪病专题2010年学术年会论文集》1184-1188）。但该程序不仅增加了原材料投入，而且增多了生产环节和人力投入，增加了废弃物排放量，使生产成本至少增加1倍以上，即便如此，国内许多厂家用此方法生产的生产的圆环病毒疫苗，其病毒效价在10⁴以下，免疫效果较差。也有人采取筛选对圆环病毒高度敏感细胞系培养圆环病毒其病毒含量均在10⁶以上，免疫效果较好，但生产成本依然高昂。因此如何提高圆环病毒的培养效价是国内厂家目前改良工艺的主攻方向。

此外，由于普通圆环病毒在培养过程中不能使细胞发生病变表现（严伟东《猪病专题2010年学术年会论文集》1184-1188），病毒的收获时间确定具有很大的盲目性，这也是造成目前疫苗质量较差的原因之一。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的猪圆环病毒PCV2，该病毒在宿主细胞PK15可大量扩增，且可使宿主细胞PK15发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡。

本发明的一个目的是提供一种与猪圆环病毒共培养的PK15细胞株，该细胞携带PCV2病毒，能稳定培养并产生PCV2病毒，细胞株发生可视轻微病变，但能稳定传代培养并产生PCV2病毒。

本发明的另一个目的是提供一种大量制备PCV病毒的方法。

本发明的再一个目的是提供新的细胞株在培养猪圆环病毒中的应用

本发明的再一个目的是猪圆环病毒PCV2在预防和治疗猪圆环病毒病毒中的应用。

本发明公开了一株新的猪圆环病毒PCV2突变株，其特征在于：PCV2突变株至少有9个位点的碱基突变，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该病毒是猪圆环病毒GY-PCV2株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201660。

猪圆环病毒GY-PCV2株是从表现猪圆环病毒病症状的病猪体内分离的，分离方法包括下列步骤：

（1）无菌操作取下已有明显临床症状的为患猪圆环病毒病的病猪的腹股沟淋巴结，用含2万单位/ml的青霉素和200ug/ml的链霉素混合液洗涤7次以上，并捣成均浆，离心，过虑除菌获得病料液；

（2）将病料液与含2%血清的DMEM维持培养基1:1混合；

（3）接种混合液至对数生长期的PK-15细胞上进行感染；

（4）感染并培养24小时后弃去接种液，加少许3mM的D-氨基葡萄糖铺盖细胞，继续培养2小时，PBS洗涤5次，加入2%血清的DMEM维持液继续培养。

（5）培养72小时后，取上清液，用PCV2专用PCR检测试剂盒检测，留下阳性表现最强的细胞继续盲传5代，收获第5代上清液，4000转/分离心30分钟，再次病毒测定确证为强阳性后收集，冻干保存或直接液氮冻存；