[发明专利]用于肝癌体外诊断试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于肝癌体外诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

2015年世卫组织报告指出，中国肝癌发病率高居全球之首。肝癌全球有78.2万新发病例，74.5万死亡病例。其中，中国的新发病例数及死亡病例数均占了约50%左右；也就是说我国每年有40万新发肝癌患者有待于诊断。另外，还有大量的肝硬化病人要做肝癌的鉴别诊断。目前，中国慢性乙型肝炎病人约为2000万人，其中近25%～30%慢性乙肝病人可发展为肝硬化,由此可估算出大概有600万肝硬化病人要做鉴别诊断。

临床治疗发现，肝癌的早期诊断及治疗非常重要。肿瘤标志物(tumor markers，TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的标志肿瘤存在和生长的一类物质。这些物质在正常成人中不存在或者是在癌症患者中出现的水平显著高于正常人。目前肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，这一检测技术可先于X光片、超声、CT、MRI或PET-CT等物理检查发现肿瘤。可用于高危人群恶性肿瘤的筛查，肿瘤诊断与鉴别诊断，评估治疗的效果，预测或监视肿瘤复发或转移。目前，医院出现的肝癌诊断试剂都是检测一些常见的肿瘤标记物，灵敏性及准确性都偏低。市场上还没有针对肝癌的快速高效诊断试剂盒问世，严重影响到肝癌早期发现及治疗。

发明内容

本发明的目的是针对以上述现有肝癌诊断存在的不足，提供一种灵敏度高、准确性强且使用方便高效的用于肝癌体外诊断试剂盒。

本发明另一目的是提供一种用于肝癌体外诊断试剂盒的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是：用于肝癌体外诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体是脯氨酸肽酶制得的单克隆抗体。

所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为脯氨酸肽酶制得的多克隆抗体。

所述捕获抗体为将脯氨酸肽酶克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。

所述捕获抗体的制备方法包括如下步骤：

（1）抗原的制备：把脯氨酸肽酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。

所述检测抗体为将脯氨酸肽酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。

所述检测抗体的制备方法包括如下步骤：

（1）抗原的制备：把脯氨酸肽酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；

（2）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。

所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。

用于肝癌体外诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：

（1） 抗原的制备：将脯氨酸肽酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；

（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；

（4）捕获抗体包被：

①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH9.6) 将浓度为 1μg/ml 的捕获抗体包被 微量滴定板的孔；②. 封盖微量滴定板并在 4℃ 下孵育过夜；③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；

（5）封闭和加样：每孔添加 200μl 封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。

用于肝癌体外诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：

（1） 抗原的制备：将脯氨酸肽酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；