[发明专利]一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法及应用

权利要求书

1.一种血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶在制备检测血液中癌症标志物甲胎蛋白的试剂中的应用，其特征在于：用于血液中癌症标志物甲胎蛋白的检测，包括酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白和金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白；

所述的通过酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白具体方法为：通过酶催化TMB-H₂O₂比色检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，即采用Hemin- AuNCs复合物作为抗体标记物的ELISA比色检测方法，步骤为：

1）建立待测样品校准曲线方程：

ⅰ）取基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶，加PBS缓冲液配制为2mL 0.1-0.4mg/mL的Hemin-AuNCs溶液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺使其浓度分别为100 mM和80 mM，于20～25℃活化培育30 min；

ⅱ）将步骤ⅰ）得到体系与AFP抗体溶液混合，使混合后AFP抗体浓度为3.0μg /mL，4℃孵育10～12h后，用柠檬酸缓冲液或PBS缓冲液洗涤，得到标记Hemin-Au的AFP抗体，备用；

ⅲ）向清洗干净的96孔板中加入10～40 μL质量浓度为0.5%的壳聚糖的柠檬酸缓冲液，20～25℃放置0.5～2 h，然后加入20 μL的质量浓度为2.5%的戊二醛的PBS缓冲液，20～25℃反应0.5～2 h；

ⅳ）取AFP抗体溶液，采用PBS缓冲液配制为AFP抗体浓度0.25 mg /m L的AFP抗体稀释液，将步骤ⅲ）得到体系用PBS缓冲液清洗两次后，加入20 μL AFP抗体稀释液，20～25℃培养5～10 h；

ⅴ）将步骤ⅳ）得到体系用PBS缓冲液清洗后，加入质量浓度为0.05～0.2%的牛血清白蛋白，然后于20～25℃培养1h以封闭非特异性蛋白结合位点；

ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.01～0.30 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；

ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；

ⅷ）分别向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200μL TMB-H₂O₂底物显色液，20～25℃反应20 min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线，得AFP校准曲线方程；

2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白含量：

ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；

ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；

ⅶ）将步骤ⅵ）得到各体系中，分别加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；

ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入200 μL TMB-H₂O₂底物显色液，20～25℃反应20min后，在波长652nm下测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程，确定人体血清样品甲胎蛋白的含量；

所述的金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白，即采用Hemin-AuNCs复合物作为抗体标记物的金催化银沉积检测方法，步骤包括：

1）建立待测样品校准曲线方程：

步骤ⅰ）-ⅴ）同上述方法；

ⅵ）取AFP抗原溶液，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.005～25 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液，于37℃培养1 h后，分别用PBS缓冲液洗涤两次；

ⅶ）向步骤ⅵ）得到体系中加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；

ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入100 μL 浓度为50～120μg mL^-1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0～5.0 mg mL^-1的AgNO₃水溶液，20～25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度校准曲线及其关系方程，即待测样品校准曲线方程；

2）检测待测人体血清样品甲胎蛋白含量：

ⅰ）-ⅴ）同步骤1）；

ⅵ）取待测人体血清样品，分别加入到步骤ⅴ）得到体系中，配制为0.05～55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液，37℃培养1 h后，用PBS缓冲液洗涤两次；

ⅶ）向步骤ⅵ）得到体系中加入20μL步骤ⅱ）制备的标记Hemin-Au的AFP抗体，37℃培养1 h，然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin-Au的AFP抗体；

ⅷ）向步骤ⅶ）得到各体系中，分别加入100 μL 浓度为50～120μg mL^-1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0～5.0 mg mL^-1的AgNO₃水溶液，20～25℃反应5 min后，在波长410nm下分别测定吸光度值，建立AFP浓度-吸光度标准曲线，得AFP标准曲线方程，然后根据步骤1）AFP浓度-吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程，确定人体血清样品甲胎蛋白的含量；

所述的基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法包括以下步骤：

（1）取氯化血红素，室温下加水搅拌，配制为浓度0.8 mg/mL的Hemin溶液，4℃储存；取氯金酸加水，配制为浓度10mM的 HAuCl₄溶液；取NaOH加水，配制为浓度1.0 M的 NaOH溶液；

（2）将步骤（1）制备的HAuCl₄溶液与Hemin溶液各1.0 mL等体积混合，5 min后，温剧烈搅拌下加入120μL NaOH溶液，然后在37℃水浴中继续搅拌，反应8 h，8000 r/s离心20 min，取上清液采用规格为14 KDa的透析袋，去离子水透析12h处理，得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶。