[发明专利]一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法

说明书

本发明提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，包括以下步骤：将口蹄疫合成肽疫苗破乳，将破乳后的抗原样品采用竞争ELISA方法进行定性定量检测；所述破乳方法为：将口蹄疫合成疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。本发明提供的破乳方法破乳能力更强，使样品无需进行纯化处理即可测定，缩短了检测时间；本发明采用竞争ELISA方法进行定性定量检测抗原浓度，得到的标准曲线斜率会大于常规间接竞争法，从而大大提高了检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及油佐剂疫苗检测技术领域，具体涉及一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法。

背景技术

现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100％的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高(BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的质量检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此需要尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。

当前国家对疫苗的检验正逐步过渡到对疫苗内抗原的检测，而当前较为普遍的方法为疫苗破乳后对抗原进行检测，通过将疫苗进行破乳处理，使抗原转移至水相中，继而对其进行后续的检测分析。由于疫苗乳化过程中所使用的油佐剂中成分复杂，含有表面活性剂，免疫增强剂等物质存在，破乳后的水相中往往会含有上述杂质和破乳剂，行业内并没有能够去除上述杂质和破乳剂的方法，而杂质及破乳剂等还会大大影响其后的检测过程，造成信号掩盖或干扰，压低了抗原信号的强度，甚至无法有效检测到其中的抗原，由于其中杂质的随机分配性，造成其检测方法的重复性不佳，同时增加了仪器维护成本。

口蹄疫合成肽疫苗是一种通过人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成的保护性短肽。现有定量测定方法通常有Lowry法、BCA法、HPLC等方法。且现有的定量方法中，由于疫苗破乳后，疫苗水相成分较复杂，待检样品通常需要耗费大量时间纯化后才能达到检测要求，且很多常规方法检测灵敏度有限。

酶联免疫吸附试验(ELISA)一起快速、方便、特异、可定量等优点，在很多领域中得到广泛应用。常规的间接竞争ELISA中，抗原与有限浓度的抗体同时加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中进行反应，抗体与游离的抗原、固相化的抗原结合率概率为50％，得到的结果绘制的标准曲线斜率较低，这使得检测灵敏度较低。不能很好的反应口蹄疫合成肽疫苗中有效抗原含量。

目前，对于口蹄疫合成肽疫苗抗原含量定量检测没有通用准确的方法。急需研发一直更加快速，有效，方便的油佐剂疫苗的定性定量检测方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法。通过将口蹄疫合成肽疫苗采用特殊的破乳方法进行破乳，再对破乳后的水相抗原样品直接进行竞争ELISA方法，可准确对疫苗进行定性定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种油佐剂疫苗的快速定性定量检测方法，包括以下步骤：将口蹄疫合成肽疫苗破乳，将破乳后的抗原样品采用竞争ELISA方法进行定性定量检测；

所述破乳方法为：将口蹄疫合成疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。取水相经液相色谱检测，抗原回收率可达90％以上。

优选地，破乳剂中有机溶剂选自乙腈、乙醇中的一种，酸选自三氟乙酸、盐酸中的一种。

优选地，油佐剂疫苗与破乳剂按体积比9:1～5:5进行混合。破乳剂含量过高会增加后续对水相样品冻干或浓缩的处理时间，过低则无法破乳。