[发明专利]高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法

说明书

本发明公开了高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，属于发酵工程领域。本发明通过建立大肠杆菌高密度发酵的方法，是菌体生长周期大大缩短，从原来原始菌的100h缩短到现在的48h，时间缩短52％；在现有的催化工艺基础上，催化得到的产物浓度比现有重组菌提高110.8％，达到506g/L；生产效率与原始红球菌比较提高212％，达到508g/(L·h)。

技术领域

本发明涉及高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

腈水合酶(NHase,EC 4.2.1.84)是一种能够催化腈类物质生成酰胺类物质的酶，在工业生产中有广泛的应用。烟酰胺是一种重要的药物和杀虫剂合成中间体，在食品工业中也有广泛的应用。

目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成烟酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，需要100h，并且生产效率不高，只有162g/(L·h)。

目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/L。

发明内容

本发明将旨在缩短微生物发酵生产烟酰胺时的菌体生长周期并提高产物浓度。

为此，本发明提供了一种以高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，包括以下步骤：

(1)接种：向装液量为40％～42％的发酵罐中，以接种量6～8％接入E.coilBL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G的种子培养液，设置初始pH为6.8～7.2，培养温度为36～37℃，初始转速180～200r/min，通气量为4.8～5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在28～30％；

(2)补料：在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.18～0.2h^-1进行指数流加补料培养基；

(3)诱导：当OD₆₀₀达到58～62时，调整温度为28～30℃，以0.20～0.22g/(L·h)的恒速流加140～150mL的诱导剂；

(4)合成烟酰胺：调整温度为25～28℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD₆₀₀＝150～160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。

在本发明的一种实施方式中，整个发酵过程中，控制pH为6.8～7.2。

在本发明的一种实施方式中，整个发酵过程中通过流加25％的氨水调节pH，使罐内pH始终维持在6.8～7.2。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)，向装液量为40％的发酵罐中，以接种量6％接入种子培养基，设置初始pH为7，培养温度为37℃，初始转速200r/min，通气量为5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在30％。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)，在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.2h^-1进行指数流加补料培养基。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)，当OD₆₀₀达到60时，调整温度为30℃，以0.22g/(L·h)的恒速流加150mL的诱导剂。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)，调整温度为28～30℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD₆₀₀＝160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。

在本发明的一种实施方式中，采用5L Winpact全自动发酵罐。