[发明专利]一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法

权利要求书

1.一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：

(1)抗原致敏及免疫抑制阻断：

a、取体积比为100:2-5的淋巴细胞培养基、胎牛血清混合，得淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物；在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中加入白细胞介素2，调整所述白细胞介素2在淋巴细胞培养基、胎牛血清混合物中的浓度为100-1000单位/毫升，得培养液A，备用；

b、取部分培养液A，加入非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞，调整培养液体积，使所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液A中的密度为1*10⁶-2*10⁶个/毫升，培养12-24小时；

c、另取部分培养液A，加入抗免疫抑制抗体进行免疫抑制阻断，得培养液B，备用；

d、将在培养液A中培养12-24小时后得到的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞全部吸出，转移至离心管中，离心3-5分钟，离心力为300-350g；离心完成后弃掉上层培养液；

e、在离心完成后弃掉上层培养液的非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞中加入培养液B，调整所述非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞在培养液B中的浓度为0.5*10⁶-1*10⁶个/毫升，培养24-48小时后，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5-1微克/毫升，继续培养24-48小时，得非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物；

(2)T细胞亚群分离和刺激增殖：

采用常规分选方法对非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞培养物进行亚群分选，得到CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群，将两个亚群分别置于X-VIVO培养基中独立培养并加入激活试剂，培养密度为1*10⁵-1*10⁷个/毫升，各组每隔3天进行半量换液，培养9-12天后分别进行细胞计数；

其中，CD4+、CD25-辅助T细胞亚群的激活试剂为：CD3/CD28磁珠及白细胞介素7，调整所述CD3/CD28磁珠在所加入体系中为1-5个/细胞、白细胞介素7的浓度为5-20纳克/毫升；

CD8+杀伤性T细胞亚群的激活试剂为：anti-CD3、白细胞介素7及白细胞介素21，调整所述anti-CD3在所加入体系中的浓度为5-50纳克/毫升、白细胞介素7的浓度为2-20纳克/毫升、白细胞介素21的浓度为1-5纳克/毫升；

(3)T细胞亚群的再刺激和快速增殖：

上阶段培养结束后，加入经15-35千戈瑞X射线辐照的外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞与CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群经培养9-12天后所得细胞的数量比例为100-500:1，加入细胞培养用常规人工合成肿瘤多肽，调整所述细胞培养用人工合成肿瘤多肽在所加入体系中的浓度为0.5-3微克/毫升，继续培养12-15天，培养过程中控制培养密度为1*10⁶-2*10⁶个/毫升；

(4)收获：

培养结束后，在CD4+、CD25-辅助T细胞亚群和CD8+杀伤性T细胞亚群中分别取样培养细胞，进行微生物、内毒素、流式细胞学和细胞因子分泌分析后，混合两个亚群细胞，即得。

2.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-程序性死亡受体1，调整所述抗-程序性死亡受体1在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。

3.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，调整所述抗-细胞毒T淋巴细胞相关抗原4在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。

4.如权利要求1所述的一种非前哨淋巴结来源抗肿瘤T细胞的体外扩增方法，其中：所述抗免疫抑制抗体是抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3，调整所述抗-T细胞免疫球蛋白黏蛋白3在培养液A中的浓度为5-30微克/毫升即可。