[发明专利]一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉菌株

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉突变菌株。所述突变菌株能显著提高脯氨酸蛋白酶的产量，在摇瓶发酵条件下其脯氨酸蛋白酶活力达到65.2u/ml，比出发菌的发酵酶活提高了84.2%，取得了意料不到的技术效果。从而有利于降低脯氨酸蛋白酶的生产成本，促进该酶的广泛应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉突变菌株及其应用。

技术背景

脯氨酸蛋白酶（prolyl endoprotease, PEP）是一类高效水解蛋白质或者多肽中脯氨酸羧基端肽键的蛋白酶。它能有效降解生物体内富含脯氨酸的生物活性肽，如催产素、促甲状腺激素释放素等，这些活性肽含量的高低与PEP的活性升降有关。在食品与发酵工业, 脯氨酸内肽酶可能是一种有价值的酶类,如能通过水解啤酒中富含脯氨酸的蛋白多肽, 阻止其与多酚类物质形成大聚合物浑浊沉淀，从而提高啤酒的非生物稳定性。2005年，Enens等证明了该酶在蛋白水解物中的去苦味作用。此外，鉴于PEP的特异性，该酶还有可能作为一种分子生物学的工具酶，用于蛋白质序列测定、特异位点的酶切、肽段的修饰和加工等。

报道表明，已经多种物种和组织来源的脯氨酸蛋白酶，既存在于细菌、真菌中，也存在于植物以及动物组织中。不同来源的脯氨酸蛋白酶在底物特异性、热稳定性、最适pH、有机溶剂抗性和盐离子的抗性方面表现出较大的差别。

脯氨酸蛋白酶最早在人子宫的匀浆液中被发现。以后，又陆续在脑膜炎黄杆菌、荚膜鞘氨醇单胞菌、猪的大脑和人的T淋巴细胞中发现脯氨酸蛋白酶。随后相继有克隆和异源表达脯氨酸蛋白酶的报道。

微生物产脯氨酸内肽酶的研究始于1978年，Yoshimoto和Walter等首先通过对500多个微生物的筛选试验中，发现仅在黄杆菌属中发现了类似PEP活性的蛋白酶，并在1980年提纯到该酶，对其性质进行了描述，发现其为一种胞外的蛋白酶。Kanatani等分离得到一株具有产PEP能力的菌株，分类学分析显示该菌株为气单胞菌属，其氨基酸序列和黄杆菌属以及猪来源的PEP同源性分别为56%和41%。2002年，Capiralla等从极端嗜盐微生物盐生盐杆菌分离纯化得到疏水氨基酸特异性内肽酶，并对其性质进行了研究，同时指出他们在蛋白质水解产物中脱苦味的潜在应用。该研究应用肽类底物特异性显示了次末端含有脯氨酸的肽类以及偏好水解羧基末端疏水性氨基酸的肽类有更高的特异性。Szwajcer-Dey等学者筛出一株生产PEP菌株黄单胞菌（Xanthomonas sp.）。Kanatani等筛选获得一株生产PEP的菌株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilic）。日本学者Oyama等研究了产PEP的菌株，分类学命名为假单胞菌（Pseudomonas sp. KU-22）。

脯氨酸蛋白酶是一类可以特异性水解位于多肽内脯氨酸残基的羧基端肽键的裂解酶，尽管目前已有部分的细菌源、真菌源和植物源的脯氨酸内肽酶被发现，但野生型生产菌株存在一定局限性，利用传统育种等手段很难提高其产量，因此亟需利用分子生物学手段筛选出高产脯氨酸蛋白酶菌株以满足市场需求。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉突变菌株。所述突变菌株是通过紫外诱变的方法筛选到的，能大幅提高脯氨酸蛋白酶的产量，有利于脯氨酸蛋白酶的广泛应用。

本发明一方面提供了一种黑曲霉重组菌株，其携带有编码序列为SEQ ID NO：4的脯氨酸蛋白酶基因。

本发明另一方面涉及一种突变菌株，是将上述黑曲霉重组菌株进行紫外诱变筛选到的，命名为黑曲霉Su-F13（Aspergillus niger Su-F13），已于2016年11月30日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016698。

本发明还涉及所述黑曲霉突变菌株在脯氨酸蛋白酶生产中的应用。