[发明专利]AtAGM2与AtAGM3编码基因及酶的制备与应用

说明书

本发明公开两个来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶(Arabidopsis thaliana N‑acetylpHospHoglucosamine mutase 2，3；AtAGM2，AtAGM3)的基因序列及其应用。本发明提供了一种制备乙酰葡萄糖磷酸变位酶的方法，即将酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达变位酶的大肠杆菌重组菌株，用重组菌株异源表达制备出AtAGM2与AtAGM3.该两种AGM蛋白均具有催化己糖磷酸异构体的变位酶活性，可以应用到酶法催化合成尿苷二磷酸乙酰葡萄糖胺(UDP‑GlcNAc)或生产己糖磷酸异构体领域。

技术领域

本发明涉及两种乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶AtAGM2与AtAGM3的基因序列及其制备方法，尤其涉及这两种酶在核苷酸糖及磷酸己糖异构体生产中的应用。本发明还提供了这两种乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶的重组质粒和重组基因工程菌株，以及两种酶的酶学性质。

背景技术

乙酰葡萄糖胺(GlcNAc，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖)是葡萄糖的一种氨基糖衍生物。在生物体内，是仅次于葡萄糖的一种具有重要生理生化功能的单糖。常以UDP-GlcNAc形式参与主要包括神经系统和免疫系统在内的诸多生物反应过程和生物体内多种糖缀合物的结构组成。在生物体内，生成UDP-GlcNAc的主要途径是氨基己糖途径(Hexosaminebiosynthesis pathway)。这一途径是糖酵解的分支，都以己糖代谢途径的中间产物果糖-6-磷酸(Fructose-6-P)为起始底物，在多种酶的协同催化作用下，最终合成UDP-GlcNAc。根据合成过程中催化反应的顺序及合成途径所涉及酶的来源不同，分为真核，原核以及拟菌病毒的UDP-GlcNAc合成途径。目前，氨基己糖途径已经被广泛的研究，但是植物中的氨基己糖途径中的第三个酶乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶至今尚未研究和应用，所以植物中的氨基己糖途径仍未被打通。

另外UDP-GlcNAc作为生物体内重要的活性核苷糖，可被大量用于寡糖的生产，进而被开发成医药品或功能性材料。但由于其生产方法的限制，目前其供应量仍较小，价格也很高。目前已经有研究使用无细胞催化的多步酶催化反应体系，偶联了葡萄糖激酶，AGM与GlcNAc-1-P尿苷转移酶(GlmU)三个酶，以GlcNAc作为底物生产UDP-GlcNAc。无论是体内表达体系还是体外表达体系，来自酵母的AGM l的可溶表达水平均很低，影响了产物合成的效率和成本。所以提供一种高活性、高表达的AGM具有十分重要的意义。

磷酸己糖的价格十分的昂贵，目前主要是化学方法合成，生产步骤繁琐。Sigma以及Santa Cruz等公司的储量很少甚至断货。由于合成方法的限制，导致磷酸己糖不同的异构体之间价格差异巨大(几十甚至上百倍)；如GlcN-6-P的价格29元/mg，而GlcN-1-P的价格则是460/mg。所以探索新的磷酸己糖的制备方法，特别是价格昂贵的磷酸己糖的制备方法势在必行。

针对上述乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶的研究现状及其在应用中存在的问题，本发明公开了两个来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶(Arabidopsis thaliana N-acetylpHospHoglucosamine mutase，AtAGM)的基因序列及其制备方法。这两种酶均具有催化不同己糖磷酸异构体的活性，与另外一个来与拟南芥中的乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶AtAGM1相比，三者催化反应的效率相差不大，并且具有类似的酶学性质，均可以应用于无细胞酶法催化合成UDP-GlcNAc，或己糖磷酸异构体的生产中。

发明内容

本发明的第一个目的是提供两个植物来源的乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶AtAGM2与AtAGM3及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶AtAGM2与AtAGM3的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶AtAGM2与AtAGM3的重组表达质粒和重组基因工程菌株。