[发明专利]一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法

说明书

本发明涉及一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，首先用原始生殖细胞诱导培养基诱导小鼠毛囊干细胞分化为卵子的原始生殖细胞；然后将分化的原始生殖细胞转移到卵母细胞诱导培养基中诱导其向卵子分化，诱导分化的第一阶段，出现直径30μm‑50μm的大细胞；诱导分化的第二阶段，培养基中会出现直径不低于50μm的大细胞；诱导分化的第三阶段，大细胞呈现典型卵母细胞形态、有透明带结构出现、表达卵母细胞特异基因。本发明通过培养及诱导小鼠毛囊干细胞，成功专向分化为卵母细胞，对机体伤害小、无伦理问题限制，有助于推动干细胞临床应用，并为干细胞治疗不孕不育提供了新思路。

技术领域

本发明生物医学的干细胞与组织工程学技术领域，尤其涉及一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法。

背景技术

据统计，世界上现有不孕不育人群占育龄妇女的10% 左右；约1/5的妇女处于绝经期年龄段，随着人口老龄化进程加快，越来越多女性将在雌激素匮乏状态中度过更长时期；女性由于在工作和生活中面临的各种压力，致使卵巢早衰出现年轻化趋势。在雌性不如动物生殖系统发育过程中，卵巢内绝大多数卵母细胞在发育过程中发生凋亡，因此在雌性生殖周期内能够发育成熟并排出的卵母细胞相比整个原始卵泡库来说非常少，同时我们对卵母细胞发生成熟的调控机制还知之甚少。因此，通过体外干细胞分化获得卵母细胞，可以介入卵巢早衰的治疗，恢复卵巢功能，以及延缓女性绝经期的到来，同时也能使我们更好的理解动物生殖细胞发生发育过程及其机制。

综合最近研究进展，之前的研究大都采用胚胎干细胞（ESC）作为原材料，但是ESC处在哺乳动物个体发育的早期，在应用上存在伦理限制，并且取材困难，因此采用成体干细胞代替ESC向生殖细胞分化可以更好地解决问题。毛囊干细胞广泛分布于哺乳动物毛发中，取材十分方便，对机体伤害最小，同时也不存在伦理问题限制。多项研究指出毛囊干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的成体干细胞。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述缺陷并发扬优点，本发明旨在提供一种采用成体干细胞进行诱导分化培养，对机体伤害小、无伦理问题限制的卵母细胞体外培养方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法，包括将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞再次诱导分化为卵母细胞两个步骤，其中：

1）将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：

①原始细胞准备：分别提取培养了1-2代绿色荧光转移基因小鼠的毛囊干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将毛囊干细胞与处理后的成纤维细胞按照数量比1:1的比例混合后待用；

②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生长因子, 15ng/ml~25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子；培养温度35℃-38℃，湿度不低于80%，环境中CO₂浓度4%-6%；

③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在培养箱中，按常规方式进行培养8-10天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；

2）将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞具体为：