[发明专利]一种皮肤干细胞经异位发育分化为精子的技术方法

权利要求书

1.一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，包括将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞两个步骤，其特征在于：

1）将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为：

①皮肤干细胞准备：分别提取培养了1-2代绿色荧光转移基因小鼠的皮肤干细胞与野生型小鼠成纤维细胞，并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理，然后将皮肤干细胞与处理后的成纤维细胞按照质量比1:1的比例混合后待用；

②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基，并在该培养基内加入以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25 ng/ml骨形态发生因子、0.20mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生长因子, 15ng/ml~25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子；培养温度35℃-38℃，湿度不低于80%，环境中CO₂浓度4%-6%；

③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基，然后将培养基放置在培养箱中，按常规方式进行培养8-10天，即获得诱导分化出的原始生殖细胞；

2）将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞具体为：

①准备受体鼠；

②将1）中步骤③获得的原始生殖细胞稀释至0.8×10⁶个/L ~1.2×10⁶个/L，然后利用常规睾丸注射技术将其注射进行受体睾丸曲细精管内，培育至通过常规方法检测出现典型精子形态的细胞，则所述具有典型精子形态的细胞为所需精子细胞。

2.根据权利要求1所述的一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，其特征在于：在步骤1）将皮肤干细胞诱导分化为原始生殖细胞和将原始生殖细胞植入受体鼠睾丸获得精子细胞之间还增加有原始生殖细胞专向培养步骤，具体为：将1）中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养，所述专向培养基具体为：以DMEM高糖培养基作为基础，其内添加以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计15ng/ml~25 ng/ml骨形态发生因子、0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12mmol/L非必需氨基酸，1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺，0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 15ng/ml~25ng/ml表皮生长因子, 30ng/ml~50 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子；培养时间3-5天，温度35℃-38℃，湿度不低于80%；环境中CO₂浓度4%-6%。

3.根据权利要求1所述的一种皮肤干细胞经过体内发育分化为精子的方法，其特征在于：原始生殖细胞在受体鼠睾丸内的培育周期为25天-40天。