[发明专利]木犀草苷的偶联物及其制备方法与应用

说明书

木犀草苷的偶联物及其制备方法与应用。本发明公开了一种通式(I)的木犀草苷的偶联物，由木犀草苷与产生免疫原性的载体物质钥匙孔蓝蛋白(KLH)偶联构成，其中n为与一个钥匙孔蓝蛋白分子结合的木犀草苷的分子数，KLH为钥匙孔蓝蛋白，分子量范围是450KDa～13000KDa。本发明还公开了所述的偶联物的制备方法，即将木犀草苷与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明的木犀草苷的偶联物通过免疫新西兰大白兔，制备了效价达到1∶64000的抗血清，其最低检测限为29.27ng/ml。本发明具有简便，快捷，特异，准确的特点，为制备木犀草苷的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。

技术领域

本发明涉及一种小分子半抗原的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及木犀草苷的偶联物及其制备方法与应用。

背景技术

本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书：

木犀草苷：中国标准品质检所产品

KLH：钥匙孔蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)，Sigma公司产品

DMF：二甲基甲酰胺，北京百灵威(J&K)公司产品

高碘酸钠：北京百灵威(J&K)公司产品

透析袋：北京索莱宝(Solarbio)公司产品

PBS：磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Saline)(0.01M，pH＝7.40)

CBS：碳酸盐缓冲溶液(Carbonate Buffer Saline)(0.05M，pH＝9.6)。

金银花药用历史悠久，是我国常用的传统珍贵药材，广泛应用于医药、食品和日用品工业中。目前，金银花和山银花药材混用严重，质量差别巨大。市场上山银花价格约为金银花的1/3，许多不良厂商采用山银花冒充金银花入药以获得高额利润。金银花与山银花外观性状接近，不易鉴别，真假难辨，亟待建立快速灵敏的检测方法。

2010版《中国药典》确定了以木犀草苷作为金银花的标志性成分来控制其质量，同时，将是否含有木犀草苷作为区别正品金银花和山银花等同科植物的主要化学指标。木犀草苷(Lu teoloside)又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-glucoside)，青兰苷(Cynaroside)，为黄酮苷类化合物，分子式为C₂₁H₂₀O₁₁，分子量：448.41。现代药理学证明木犀草苷具有较强的呼吸道杀菌作用，可增强毛细血管的舒张，降低胆固醇，对缺血缺氧培养的心肌细胞具有保护作用。随着对金银花有效成分的分析与研究，木犀草苷的抗病毒活性也逐渐明晰，在抗肿瘤方面表现出较好的作用。

目前，测定金银花中木犀草苷含量主要采高效液相色谱法(HPLC法)和紫外光谱法(UV)两种常用的检测方法。然而，目前运用的这些检测方法均存在不同程度的不足，UV法方法简单，操作简便，费用少，但是测定的结果准确度相对不高。HPLC法检测敏感度高，操作自动化，分离效率高，选择性好，应用范围广，具有检测准确的优势，但是一般需要进行比较复杂的样品前处理，对仪器操作人员要求较高、高效液相色谱仪的价格及日常维护费用较贵，分析成本较高，不能体现出“快速”检测，在实际工作中较难推广。因此，亟需一种简便、快速的质量分析方法，能够准确、快速地检测金银花的真伪优劣。

酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的检测手段。该方法具有快速，准确，简易，不需要专人操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的检测手段。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。木犀草苷是一种小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之半抗原。所以，必须把木犀草苷转化为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，世界上尚未有关于木犀草苷的免疫原合成及抗体制备过程的报道，不能满足检测需要，因此研究木犀草苷的免疫原的合成显得格外重要。