[发明专利]一种检测硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

本发明为检测硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被硫氰酸钠抗原的酶标板、硫氰酸钠标准品、硫氰酸钠抗体工作液、硫氰酸钠酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。检测硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标板微孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下显色剂呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中硫氰酸钠的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测乳制品中硫氰酸钠的残留量。

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测乳制品中硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒。

背景技术

硫氰酸钠（NaSCN）是生乳中天然存在的一种活性抗菌体系，其乳过氧化物酶体系（LPS)可以抑菌保鲜。1991年，WHO和FAO的食品法典委员会公布的CAC/GL 13-1991《乳过氧化物酶体系用于原料乳的保鲜指南》中，硫氰酸钠作为LPS的活化剂被允许添加到牛奶中；我国也于随后颁布标准，允许将其添加到无冷链运输体系中用于原料乳保鲜，添加量为15mg/L。

但硫氰酸钠属有毒有害物质，其主要毒性作用为以抑制细胞色素氧化酶活性为主的急性毒性与以抑制碘转运及甲状腺素合成的慢性毒性，尤其对胎儿和婴儿的脑部与神经系统发育存在较大的危害。随着社会对食品安全重视度提高及原奶冷链运输的完善，国家废除了之前的标准并于2008年12月公布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》，规定乳及乳制品中硫氰酸钠属违法添加物质。目前，我国尚未制定检测牛奶中硫氰酸钠的标准及限值。

酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、硫氰酸钠标准品、硫氰酸钠抗体工作液、硫氰酸钠酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测硫氰酸钠的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、硫氰酸钠标准品的制备、硫氰酸钠抗体工作液的制备、硫氰酸钠酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由硫氰酸钠抗原包被制备，具体步骤是将硫氰酸钠半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将硫氰酸钠包被抗原稀释成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

硫氰酸钠标准品浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。

所述硫氰酸钠抗体工作液是采用硫氰酸钠人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。