[发明专利]一种采用连续离子交换色谱技术分离核苷酸的工艺

权利要求书

1.一种采用连续离子交换色谱技术分离核苷酸的工艺，其特征在于，RNA酶解液经脱色预处理后，采用三区式两步骤的连续离子交换色谱分离四种5’-核苷酸UMP、GMP、CMP和AMP；

其中，采用三区式两步骤的连续离子交换色谱分离四种5’-核苷酸为利用12根装有凝胶型强酸性阳离子交换树脂柱的连续分离装置分离四种5’-核苷酸；

包括循环操作的两个步骤：

步骤1：

树脂柱分为吸附区、解吸区和再生区三个区，其中，吸附区为1根树脂柱，解吸区为5根树脂柱，再生区为6根树脂柱；

吸附区：按0.042g5’-核苷酸/g湿树脂的上样量吸附预处理后的酶解液，酶解液浓度：尿嘧啶核苷酸4g/L，胞嘧啶核苷酸6g/L，鸟嘌呤核苷酸10g/L，腺嘌呤核苷酸11g/L，上样时间为2h，上样流速为0.52BV/h；此时大部分UMP不与树脂发生离子交换流出，其余几种核苷酸与树脂发生离子交换并吸附至树脂中，吸附完成后，用水洗脱树脂柱，洗脱流速为1.65BV/h，水洗脱初期树脂间隙中剩余UMP被快速洗出，随后部分GMP也被洗出同时与UMP完全分离，洗脱出来的GMP的量为540mL水洗脱过程持续到CMP即将流出为止；

解吸区：5根树脂柱串联，用0.2mol/L氢氧化钠溶液洗脱，洗脱流速为3.9mL/min在倒数第二根树脂柱出口处安装三通阀，使得倒数第二根树脂柱流出液中一半流出收集AMP，另外一半流入最后一根树脂柱，最后一根树脂柱出口收集CMP；

再生区：6根树脂柱左边两根树脂柱串联设置，第三根树脂柱独立设置，第四根和第五根树脂柱串联，最后一根独立设置，从左往右分别泵入再生剂水、酸、水、碱进行再生，即：使用1.2mol/L氢氧化钠对再生区中最右边一根树脂柱进行杂质的去除，流量1.3BV/h，使用纯水以0.75BV/h流量将再生区中第四根和第五根树脂柱中氢氧化钠冲洗干净至流出液pH为9.5，使用1.2mol/L的盐酸将再生区中第三根树脂转化为氢离子型，流量1.3BV/h，使用纯水以0.75BV/h流量将再生区中第一根和第二根树脂柱中树脂间隙里的盐酸冲洗干净至流出液pH为4，再生完全；

步骤2：

12根树脂柱分为解吸区和再生区两个区，其中，解吸区为6根树脂柱，再生区为6根树脂柱；

步骤1中再生区的最后一根树脂柱切换到步骤1中吸附区的树脂柱之后与其串联，形成步骤2中的解吸区的第一部分；步骤1中解吸区的第一根树脂柱同时切换到步骤1中的再生区，作为步骤2中再生区的第一根树脂柱；步骤1中解析区的第二根及与其串联的之后的树脂柱依旧保持串联，作为步骤2中解吸区的第二部分；步骤2中解析区的第一部分和第二部分独立处理；

解吸区：

第一部分，通入水洗脱，将步骤1中未洗脱完全的剩余GMP完全洗出，通入水洗脱至两根树脂柱中的第一根树脂柱内完全为AMP，第二根树脂柱中完全是CMP，洗脱流速为3.6mL/min；

第二部分，通入0.2mol/L的氢氧化钠水溶液洗脱至前一根树脂柱中无AMP流出，并且在最后一根树脂柱出口收集AMP，体积为800mL；

再生区：同步骤1中再生区的操作；

将步骤2中解吸区第二部分第一根树脂柱切换至步骤2中的再生区作为步骤1中再生区的第一根树脂柱；步骤2中再生区的最后一根树脂柱切换到步骤1中的吸附区；步骤2中解吸区第二部分的第二根树脂柱与解吸区第一部分的树脂柱串联，作为步骤1中的解吸区；

循环进行步骤1和步骤2；保证所有树脂柱同步切换，同时再生区按照碱-水-酸-水的方向进行切换； 树脂柱切换时间优选为240min；

通过该连续离子交换色谱工艺实现了四种5’-核苷酸的连续分离，四种核苷酸也实现完全分离，并且经过六次切换之后得到四种核苷酸产物，分别是：尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸。