[发明专利]一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株高产L-异亮氨酸的基因工程菌，命名为C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该基因工程菌是将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)H5菌株敲除了编码精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及编码N-乙酰鸟氨酸-δ-氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子，所述谷氨酸棒杆菌H5菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016609。

2.如权利要求1所述的高产L-异亮氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)出发菌株是筛选得到的突变菌株，命名为Corynebacterium glutamicum H5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016609，其分类为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，属于革兰氏阳性菌；

(2)利用EcoRI/SalI双酶切质粒pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物，扩增argG基因上游1.22kb的核苷酸片段argG-L、及下游1.31kb的核苷酸片段argG-R，通过GIBSON连接上述3个片段，构建重组质粒argG-pk18mobsacB，该质粒即为argG基因的敲除载体，其中，扩增argG-L、argG-R核苷酸片段所用的引物为：

argG-L-FP:5‘-CTATGACATGATTACGAATTCGTGCCACTGGTGAACTCCTTG-3’

argG-L-RP:5‘-TGAAAAGGTGGCTTATGCATGTGTTGAAAGGGTTGGTATT-3’

argG-R-FP:5‘-AACCCTTTCAACACATGCATAAGCCACCTTTTCAAGCATC-3’

argG-R-RP:5‘-AGGTCGACTCTAGAGGATCCTTCTTCATCAGTGAGATCGA-3’

(3)将步骤(2)中的重组质粒转化步骤(1)中所述出发菌株Corynebacteriumglutamicum H5，通过同源重组获得argG基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargG；

(4)继续利用EcoRI/SalI双酶切质粒pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物，扩增alaT基因上游1.42kb的核苷酸片段alaT-L、及下游1.51kb的核苷酸片段alaT-R，通过GIBSON连接上述3个片段，构建重组质粒alaT-pk18mobsacB，该质粒即alaT基因的敲除载体，其中，扩增alaT-L、alaT-R核苷酸片段的引物为：

alaT-L-FP:5‘-ATGACATGATTACGAATTCGCCACTTTGGACTAATCAATAT-3’

alaT-L-RP:5‘-ATGCGGCCGCTTTTATGCATTGGAAGGTTGGCGATCATG-3’

alaT-R-FP:5‘-CAATGCATAAAAGCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATAC-3’

alaT-R-RP:5‘-TTGCATGCCTGCAGGTCGACCGGTGTTTCCACCATGCGG-3’

(5)将步骤(4)中的重组质粒转化步骤(3)中所述的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargG，通过同源重组获得alaT基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT；

(6)利用NsiI/NotI双酶切重组质粒alaT-pk18mobsacB，回收8.7kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因组为模板，设计引物扩增ilvC基因片段；以大肠杆菌表达载体PVB220为模板，设计引物扩增PlacUV5启动子片段；以大肠-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19为模板，设计引物扩增终止子rrnB片段；通过GIBSON连接上述4个片段，构建重组质粒ilvC-alaT-pk18mobsacB，该质粒即为ilvC操纵子的插入载体。其中，ilvC操纵子包括PlacUV5启动子、ilvC基因及rrnB终止子3个片段，扩增3个片段所用的引物为：

placUV5 FP:5‘-TCGCCAACCTTCCAATGCATGTAGAGGATCGAGATCTCCA-3’

placUV5 RP:5‘-TAAAGCAGTTCAATAGCCATATGGCTGCTGCCCATGGAAT-3’

ilvC FP:5‘-ATTCCATGGGCAGCAGCCATATGGCTATTGAACTGCTTTA-3’

ilvC RP:5‘-tctcatccgccaaaacagccTTAAGCGGTTTCTGCGCGAG-3’

rrnB FP:5‘-CTCGCGCAGAAACCGCTTAAggctgttttggcggatgaga-3’

rrnB RP:5‘-TGCAAAGGAGATGCGGCCGCagagtttgtagaaacgcaaa-3’

(7)将步骤(6)中的插入载体转化步骤(5)中所述的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT，通过同源重组获得在alaT基因被敲除的位点插入了ilvC操纵子的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC。