[发明专利]一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术中的海水鱼类分子标记和物种鉴定技术，具体涉及一种源于许氏平鲉的一对微卫星引物及其用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法。

背景技术

鲉科鱼类在全世界范围内包含有300多个种，从近海潮间带到一千米深的深海都有分布，拥有极其丰富的物种类型和栖息环境，是世界渔业、特别是我国渔业中十分重要的经济鱼类。平鲉属和菖鲉属均为卵胎生鱼类，许氏平鲉俗称黑鲪，是我国习见冷温性底层岩礁性鱼种，常栖息于近海岩礁地带、清水砾石区域及海藻丛生的海区、洞穴中，营半定居性生活，不进行长距离洄游。褐菖鲉为暖温性近海底层鱼类，栖息于岩礁和海藻丛中，活动范围小，亦无远距离洄游。朝鲜平鲉的相关研究还比较少，也是栖息在底层水域。三种鱼类的分布范围相近，主要分布于中国沿海以及朝鲜半岛、日本北海道以南水域。近年来，由于过度捕捞和环境变化等原因，许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉资源严重衰退。物种的区分和鉴定是各种研究工作的基础，然而许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉成体的外形比较相似，直接通过形态特征进行鉴定比较困难，特别是其发育早期阶段的鉴别更加困难。急需一种简单高效的方法对许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉个体进行大规模物种鉴定。

发明内容

本发明公开一种微卫星引物，其源于许氏平鲉，该引物（HJ5-132）的序列为：

F: CCCTCCTCTTCCATCTGT

R: ACCCTGAATGAGTTACCG。

本发明从70对许氏平鲉微卫星引物中筛选出一对能够在许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉中通用并且可以根据扩增条带大小区分三个物种的个体，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物：HJ5-132。其核苷酸序列为：

GATCTTTCTCAGAGACAGTGTAAAACTCCCACACGGCTGACATTTACTTTCACTTTTATTTGTAAACAAACCACACGTGCACACGGCGCCCGCTGTCATGCCAGAGTCGTGTAGTCTCCAGCCAGTGGCTTCTTCTCTGAATCAGCAGCTGGTTACTGTTGTCAGATGTTCGGCCAATAAATCGGTGCATCTCTGTAACCTAAATCTAGTTCCAGATAGCATTAACAATTTCACCCCCCCTCCTCTTCCATCTGTAGAGCCCAGTATACAGTGTTGGTCCCTGCCCTGTGGAATACTGAGGTCCAAGACTGGGAGCTTAAATGTATGAACAGTCTGGTGTTGGACGAGAGCCACCATGGACCCAACGCAGGTATCTCTCACACACGCACACACGCACGCACGCACGGCACGCACGCACGCACACATACACACACACACACACACATTACACACACAAAGCAGTTGTTCTTAAGCAAAGGCTAATAATGCAAAGGGACACAGGGGACCACTCGGCACACACAGTCGCTCAAACTCCGGTAACTCATTCAGGGTACATCACTTAACCTCGGCACACATGC。

本发明还公开一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱，通过如下步骤实现：

1）选取能完全识别其种类的成熟的许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉各60个，剪取每个个体少量鱼鳍分别充分剪碎，，用干净的滤纸吸除水分，分别放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl浓度为10mg/ml蛋白酶K，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5 h，直到裂解液澄清为止；

2）分别在离心管中加入200μL饱和酚、200μL24:1的氯仿/异戊醇混合液抽提三次；

3）分别用600μL的无水乙醇沉淀DNA，经70%酒精洗涤，室温晾干后溶于50μL的超纯水中；

4）紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，若完整性符合要求则；