[发明专利]基于微滴和纳米荧光探针的胞内蛋白检测方法

说明书

本案涉及基于微滴和纳米荧光探针的胞内蛋白检测方法，其将待测细胞悬液加入到微流控芯片的第一样品孔，将纳米荧光探针复合物和细胞裂解液加入到第二样品孔，将流动相加至流动相孔，驱动待测细胞悬液、纳米荧光探针复合物、细胞裂解液和流动相进入微流控管道，在流体剪切力作用下生成油包水微滴；在37℃孵育20‑60min，使待测细胞悬液中的细胞裂解后释放出胞内蛋白并与纳米荧光探针复合物结合；采用数字PCR系统或荧光拍照检测微滴的荧光强度，从而测出胞内蛋白的含量。本案无需常规流式细胞术和免疫荧光检测方法中的固定、打孔破膜，避免了抗原结合位点损失，简化了操作步骤、提高了检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种胞内蛋白检测方法，特别涉及一种基于微滴和纳米荧光探针的胞内蛋白检测方法。

背景技术

在单细胞水平上分析细胞内部组分是当前生物医学研究的迫切需求，随着单细胞测序、单细胞转录组等技术的不断发展，人类从DNA、RNA的水平深入了解细胞群体异质性。在蛋白质检测方面，免疫荧光染色和流式细胞术是最常用的单细胞胞内蛋白检测方法。但免疫荧光染色和流式细胞术检测时，需要对细胞进行固定，打孔，以便使细胞膜变得可渗透，然后孵育抗体，标记待检测靶蛋白。这种方法步骤繁琐，操作时间长，而且对固定、打孔步骤所用的试剂浓度和反应时间要求较高，固定不完全或打孔时间过长会导致细胞破裂，打孔时间过短则会导致抗体无法充分进入细胞同胞内蛋白结合，影响胞内蛋白检测的准确性。此外现有的固定方法如醛固定术等尽管可以保存细胞的形态，但是许多抗原位点也被固定方法破坏，影响蛋白检测的灵敏度和准确度。因此亟需一种快速、灵敏、稳定的单细胞胞内蛋白检测方法。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本案提供一种基于微滴和纳米荧光探针的胞内蛋白检测方法。

微流控技术是在微米级结构中操控纳升至皮升体积流体的科学技术，由于微结构的尺寸与细胞在同一尺度，而且在微流控芯片上进行生化反应具有试剂和样品量少、快速实时、大量样本平行处理、防止样品交叉污染等诸多优点，微流控技术已成为单细胞分析的有力工具。

数字微滴技术利用微流控芯片中流体的剪切力得到微小体积(1fl-10²nl)的微滴，微滴间无交叉污染，微滴可快速连续产生，可在几分钟内完成数万个微滴的生成与检测，而且芯片设计加工相对简单，已被用于细胞的高通量快速分选、蛋白、核酸检测等领域。

纳米材料尺寸分布特殊，具有表面效应、小尺寸效应以及宏观量子隧道效应，从而表现出一系列独特的电学、光学、磁学性能，将纳米材料用于生物分子标记，可显著提高检测的灵敏度。将纳米颗粒同荧光探针结合的纳米荧光探针技术已被用于单细胞RNA检测。但该技术依赖胞吞作用，无法快速准确测定细胞核酸的即时含量。因此，将数字微滴技术同纳米荧光探针技术相结合，可以在单个微滴内实现单个细胞的快速捕获、裂解、探针结合和检测，避免了细胞固定、打孔等繁琐步骤，将显著提高检测速度和检测通量，实现单细胞胞内蛋白的快速、灵敏探测。

本案通过以下技术方案实现：

一种基于微滴和纳米荧光探针的胞内蛋白检测方法，其包括：

1)制备纳米荧光探针复合物；

2)将待测细胞悬液加入到微流控芯片的第一样品孔，将所述纳米荧光探针复合物和细胞裂解液加入到所述微流控芯片的第二样品孔，将流动相加至所述微流控芯片的流动相孔，驱动待测细胞悬液、纳米荧光探针复合物、细胞裂解液和流动相进入所述微流控芯片的微流控管道，并在流体剪切力作用下生成油包水微滴，待测细胞悬液中的细胞、纳米荧光探针复合物和细胞裂解液均被包裹在微滴中；

3)在37℃孵育20-60min，使微滴中的细胞裂解后释放出胞内蛋白并与纳米荧光探针复合物结合；

4)采用数字PCR系统或荧光拍照检测微滴的荧光强度，从而测出胞内蛋白的含量。