[发明专利]脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法

权利要求书

1.脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法,其特征在于：所述的培养制备方法具体步骤为：步骤一：无菌条件下取健康女性腹部和腿部皮下脂肪约5g，浸没于含0.5-1.5％的青链霉素的PBS溶液中采用无菌塑料瓶密封后送回实验室；

步骤二：在超净台上将脂肪剪成1mm³×1mm³组织小碎块，去除小血管，用PBS缓冲液洗净血污；

步骤三：在37℃下，用0.25％的胰蛋白酶消化3-8min后,采用2倍体积0.1％的I型胶原酶消化脂肪组织块15-25min；

步骤四：将脂肪消化后的产物接种于1mm孔径的尼龙网中在含10％FBS的L-DMEM培养基中，放置在37℃下，5％CO₂的饱和湿度的培养箱内培养；

步骤五：24h后半量换液，48h后全量换液，以后每2d换液1次。约7-15天左右能在显微镜下观察到贴壁脂肪干细胞，半量换液后继续培养，去除油脂，三天后换液，脂肪干细胞已经能稳定生长，每三天换液一次，至脂肪干细胞生长铺满瓶底，即可进行传代；

步骤六：传代时去除培养基，用PBS缓冲液洗涤贴壁脂肪干细胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-EDTA，在37℃条件下作用3-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁脂肪干细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将脂肪干细胞悬液转移到50ml离心管中，在1000rpm下离心3-8min，弃上清，用适量L-DMEM培养基重悬脂肪干细胞，传代比例为1:2，接种量为5ml/瓶，置于37℃、5％CO2孵箱中培养；

步骤七：收集脂肪干细胞，加入含有Lipofectamine 2000的0.15-0.25mL的PBS缓冲液18-22ml，在37℃，5％CO2的饱和湿度的培养箱内培养1.5-2.5小时；

步骤八：取出脂肪干细胞悬液，离心5000rpm，7-12min，去除上清，加入1-3ml的PBS，-20℃和37℃反复冻融，进行细胞裂解；

步骤九：加入PBS缓冲液15-20ml，制备成脂肪干细胞美容微囊泡，在10℃-20℃下长期保存，使用时融化即可。