[发明专利]一种磷酸肽固相萃取小柱及制备和应用

说明书

本发明涉及一种基于离心辅助的磷酸肽固相萃取小柱的制备方法。通过离心辅助的方法，将合成的固定钛离子亲和色谱填料填入靠近吸液口处带有筛板的移液器吸头中制备成磷酸肽固相萃取小柱，并将小柱用于蛋白质组样品酶解液中磷酸肽的富集。该磷酸肽固相萃取小柱制备方法简单，成本低，容易操作，对磷酸肽的富集特异性高。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向复杂生物样品预处理方法技术领域，具体涉及磷酸肽固相萃取小柱的制备方法及其应用。

背景技术

蛋白质磷酸化修饰是指由蛋白质激酶催化的，把ATP上的磷酸基转移到蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内重要的共价修饰方式之一，也是目前研究的最为透彻的一种翻译后修饰。蛋白质的磷酸化与去磷酸化这一可逆过程调节着包括细胞的增殖、细胞分化、信号传导，细胞动态平衡等生命活动(文献1.Yi,T.；Zhai,B.et al.Quantitativephosphoproteomic analysis reveals system-wide signaling pathways downstreamof SDF-1/CXCR4 in breast cancer stem cells,PNAS,111,E2182-2190(2014).文献2.Humphrey,S.；Azimifar,S.et al.High-throughput phosphoproteomics reveals invivo insulin 445signaling dynamics,Nat.Biotechnol.33,990-995(2015).)。同时，异常的磷酸化调节会导致许多严重的疾病，如癌症、糖尿病、心脏病和老年痴呆症等(文献3.Blume-Jensen,P.；Hunter,T.Oncogenic kinase signalling,Nature,411,355-365(2001).)。鉴于蛋白质的磷酸化在细胞活动中起着至关重要的作用,探索蛋白质磷酸化修饰过程的奥秘及其对蛋白质功能的影响已经成为众多生物化学家及蛋白质组学家所关心的内容。

由于磷酸化蛋白质在生物体内的含量很低，磷酸肽在质谱中的磷酸化效率较低，当有大量非磷酸肽共存时更难被质谱检测到。为了提高磷酸化蛋白质组学分析的灵敏度，在对蛋白质酶解得到的复杂多肽混合物进行质谱分析前，首先要对其中的磷酸肽进行高通量、高选择性的富集。

固定钛离子亲和色谱法是目前应用最为广泛的磷酸肽富集技术。传统的固定钛离子亲和色谱材料是单分散的，材料粒径是12微米左右，一般是将材料分散在溶液中对磷酸肽进行富集，但是这种富集方法需要反复的孵育和离心步骤，耗时长并且不适用于分析微量的样品(文献4.Zhou,H.；Ye,M.et al.Robust phosphoproteome enrichment usingmonodisperse microsphere–based immobilized titanium(IV)ion affinitychromatography.Nat.Protoc.8,461-480(2013).)。鉴于此，本发明主要是通过合成一种大粒径的固定钛离子亲和色谱材料作为固相萃取基质来制备用于磷酸肽富集的小柱，这种富集方式容易操作，耗时短，易于实现对蛋白质组样品酶解液中磷酸肽的高选择性的富集。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以简便、高效、高特异性的富集复杂蛋白样品蛋白酶解液中磷酸肽的固相萃取小柱的方法。

本发明提供的方法是将大粒径的固定钛离子亲和色谱材料填入移液器吸头中制备成磷酸肽固相萃取小柱。通过离心辅助的固相萃取方法可以将磷酸肽从复杂样品蛋白酶解液中富集分离出来，然后通过质谱分析得到磷酸肽的鉴定结果。

本发明采用如下技术方案：

将固定钛离子亲和色谱填料装填入靠近吸液口处带有筛板的移液器吸头中构成磷酸肽固相萃取小柱。