[发明专利]可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白及制备方法

说明书

本发明公开一种可抗血管新生的七鳃鳗重组PR‑1蛋白，其cDNA及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。利用分子克隆手段将七鳃鳗CRBGP的PCR产物（基因片段）连接至表达载体上，于大肠杆菌Rosetta blue中进行诱导表达，经变性及复性后，得到cDNA序列含有510个bp，共编码170个氨基酸的七鳃鳗重组PR‑1蛋白。所得到的七鳃鳗重组PR‑1蛋白具有抑制血管新生功能，与七鳃鳗CRBGP重组蛋白相比产率高且分子量小，适用于工业大规模生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种产率高、分子量小的可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白及制备方法。

背景技术

血管新生是指从已经存在的血管上形成新的血管。在生物体内，血管新生是一个涉及多种细胞以及多种分子的复杂过程，包括血管基底膜的降解（激活期），内皮细胞（如人脐静脉血管内皮细胞，Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的激活、增殖、迁移，以及最终新生血管和其网络结构的重建与形成。在正常的生理过程中，血管新生对于胚胎的发育以及组织的修复过程（如伤口愈合和黄体形成等）是非常重要的，但是当体内调控血管新生的促血管形成因子以及抑制因子发生紊乱时会引起生物体产生多种疾病。陆续有研究报道证实了非预期的血管新生与多种慢性炎症性疾病密切相关，如糖尿病、老年性黄斑变性、脉络膜新生血管、银屑病、骨髓增生异常综合症、缺血性疾病以及风湿性关节炎等等，除此之外，异常的血管新生还对肿瘤的发生、发展以及转移过程产生重要影响。开发低毒、高效的抗血管新生药物是临床上治疗血管新生异常相关疾病的热点。

七鳃鳗CRBGP是从日本七鳃鳗（Lampetra japonica）口腔腺中分离纯化出的一种新型富含半胱氨酸分泌蛋白，因与富含半胱氨酸分泌蛋白（Cysteine-rich secretoryproteins，CRISPs）CRISP家族成员具有高度同源性，同样具有16个高度保守的半胱氨酸残基，因此将其命名为富含半胱氨酸的口腔腺分泌蛋白( cys teine-richbuccal glandprotein，CRBGP )。七鳃鳗CRBGP的 cDNA序列（开放阅读框）含有774bp，其蛋白质有257个氨基酸组成，质谱测定分子量为25 .6 kDa。七鳃鳗富含半胱氨酸分泌蛋白CRBGP是Na⁺通道阻断剂，不仅能够阻断海马神经元和背根神经元的Na⁺电流，还可以通过降低海马神经元和背根神经元动作单位的频率和幅度从而抑制神经元的兴奋性。中国专利号为201410528552.X的发明专利公开了七鳃鳗CRBGP在制备抗血管新生药物中的应用。然而七鳃鳗CRBGP基因序列长且具有8对二硫键，重组蛋白质表达相对困难，表达产率低，难以在产业上得以应用。虽然本领域技术人员知道其基因片段具有分子量小、蛋白表达相对容易的特点，但是并非所有的基因片段均具有表达蛋白药效强、靶向性好、具备产业价值等优点。因此，迄今为止还没有关于七鳃鳗CRBGP中的基因片段及其表达蛋白具有抑制血管新生功能的相关报道。

发明内容

本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种产率高、分子量小的可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白，其特征在于所述可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白的cDNA及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

一种上述的可抗血管新生的七鳃鳗重组PR-1蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

步骤1：以七鳃鳗CRBGP的cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应引物序列如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCACATCCGTCAACGACTGGAAGCTC -3