[发明专利]一种具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白的制备方法。本发明的活性蛋白以大球盖菇子实体为原材料，通过粉碎、超声波辅助浸提、硫酸铵盐析、超滤浓缩、离子交换层析、凝胶过滤层析、真空冷冻干燥等工艺制备而成。本发明的大球盖菇活性蛋白的相对分子质量为40KD，在体外对乳腺癌细胞MCF7具有增殖抑制活性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白的制备方法。

背景技术

大球盖菇（ Stropharia rugoso-annulata），又名皱环球盖菇、皱球盖菇、酒红色球盖菇、斐氏球盖菇、斐氏假黑伞，属于担子菌门、层菌纲、伞菌目、球盖菇科、球盖菇属。1922年，大球盖菇在美国首次被发现并命名，其后在欧洲、亚洲也相继发现其分布，野生大球盖菇在我国主要分布于云南、吉林、西藏等地。20世纪60年代，德国最早进行人工驯化栽培，我国于90年代开始引种栽培。

大球盖菇是一种色泽艳丽、嫩滑爽脆的食药用真菌，其子实体含有对人体健康有益的蛋白质、糖类、矿物质、维生素等物质，氨基酸含量达17种，人体必需氨基酸齐全，是一种无污染的安全食品。与其他栽培食用菌相比，大球盖菇具有栽培材料广、栽培技术易、适种季节长等优势，是国际菇类交易市场的十大菇类之一，也是联合国粮农组织向发展中国家推荐栽培的新菇种之一。

漆酶（Laccase, EC 1.10.3.2）是一类含铜的多酚氧化酶，于1883年由日本学者Yoshida在日本漆树漆液中首次发现，属于铜蓝氧化酶家族。一百多年来，人们对漆酶进行了大量研究，发现它广泛的存在于多种真菌和植物中。马茜茜等从云芝（ Coriolus versicolor）发酵液中分离到一种漆酶，分子量为67kDa，N端氨基酸序列为GIGPVADLTITNAAV，该酶对乳腺癌MCF7细胞和肝癌HepG2细胞有抑制作用，IC₅₀分别为2.3μM和4.4μM。Hu等从茶树菇（ Agrocybe cylindracea）子实体中分离到一种漆酶，分子量为58kDa，N端氨基酸序列为SDAQKPFVNL，该酶对乳腺癌MCF7细胞和肝癌HePG2细胞有抑制作用，IC₅₀分别为6.5μM和5.6μM。Zhao等从鸡腿菇（ Coprinus comatus）菌丝体发酵液中分离到一种漆酶，分子量为64kDa，N端氨基酸序列为AIGPVADLKV，该酶对乳腺癌MCF7细胞和肝癌HePG2细胞有抑制作用，IC₅₀分别为4.95μM和3.46μM。

大球盖菇作为一种新兴的珍稀优质食用菌，具有广阔的开发潜力和市场前景。但是，由于我国引种栽培较晚，国内有关研究较少，已有研究主要集中在育种、栽培等方面，对其活性成分的报道较少。因此，大球盖菇中活性蛋白及其功能的探讨与研究，对于其蛋白质资源的开发与利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白的制备方法。

本发明的活性蛋白以大球盖菇子实体为原材料，通过粉碎、超声波辅助水浸提、硫酸铵盐析、超滤浓缩、离子交换层析、凝胶过滤层析、真空冷冻干燥等工艺制备而成。本发明的大球盖菇活性蛋白的相对分子质量为40KD。

本发明涉及的大球盖菇活性蛋白是按照如下方法制备的：

（1）将干燥的大球盖菇子实体粉碎，过20~100目筛，即子实体粗粉；

（2）将子实体粗粉按1:20~1:40（W/V）的比例，溶解于0.9%的氯化钠溶液，置于超声波提取器中，超声波频率控制在200W-400W，2~10℃处理4~8h，6000~10000rpm离心10~30min，收集上清液，即子实体浸提液；