[发明专利]一种杂交瘤细胞株及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体

说明书

本发明提供了一种杂交瘤细胞株1A4，本发明提供的杂交瘤细胞株可以用于分泌制备高效识别狂犬病毒磷蛋白的单克隆抗体，小鼠腹水抗体采用间接酶联免疫吸附分析法测得的效价为2×10⁵；单克隆抗体与狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病原体无交叉反应，具有高特异性、高敏感性的优点，可以用于对狂犬病毒进行包括ELISA、Western‑blot和免疫荧光在内的生物诊断具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及杂交瘤细胞株1A4及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患病，发病死亡率几乎100%，全世界每年有6万人死于狂犬病，我国是狂犬病流行较为严重的国家之一。狂犬病是我国法定报告管理的乙类传染病，其病原是狂犬病毒（Rabies virus）。磷蛋白在病毒逃逸、病毒转录复制以及细胞内运动中均发挥着一定的作用，还有可能作为病毒感染的临床血清检测抗原。虽然人源抗狂犬病毒药近年来有了很大的发展，但是目前仍然没有开发出非常有效的治疗性药物，因此，狂犬疫苗仍然是目前防治狂犬病的最有效的手段。

狂犬病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，全长约12kb，分别编码酶蛋白(L)、糖蛋白(G)、基质蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、核蛋白(N)五个主要结构蛋白。其中，G蛋白和N蛋白含有多个抗原位点，能够诱导产生抗狂犬病毒抗体。磷蛋白属于病毒RNA聚合酶的辅助因子，与病毒核蛋白和L蛋白构成的复合物紧紧将病毒基因组RNA包裹。磷蛋白是该蛋白复合体中的必要中介，一方面它介导L蛋白聚合酶在N-RNA模板中的正确定位，另一方面它发挥着分子伴侣的功能，形成复合体阻止其结合到细胞RNA上并便于其传递到病毒RNA包装成为新的RNPs。磷蛋白是一种多功能蛋白，除了在病毒RNA合成中具有一定的功能外，还能够与STAT1相互作用，并抑制干扰素信号转导途径，从而克服感染细胞的抗病毒反应，对抗宿主的先天免疫反应，是先天免疫反应的关键调控因子。磷蛋白在病毒逃逸、病毒转录复制以及细胞内运动中均发挥着一定的作用，还有可能作为病毒感染的临床血清检测抗原。

自1978年Wiktor和Koprowski首次制备了狂犬病病毒的单克隆抗体以来，越来越多的实验室建立了狂犬病病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株。但主要集中于病毒核蛋白和糖蛋白上，且狂犬病毒检测试剂盒仅限于检测抗病毒糖蛋白和/或核蛋白抗体的间接ELISA检测方法，在一定程度存在假阳性。而申请人在前期研究中证实在狂犬病毒减毒活疫苗免疫的小鼠中能够与抗狂犬病毒核蛋白抗体一样大量产生抗磷蛋白抗体，推测磷蛋白也可能是一种超抗原，具有一定的临床诊断价值。竞争性ELISA可以有效降低间接ELISA中的非特异性反应。目前狂犬病毒抗体检测试剂盒仅限于狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的检测，而基于磷蛋白单克隆抗体的狂犬病毒抗体检测试剂盒尚未见报道。本发明提供的1A4单克隆抗体亚型为IgG1型，能用于竞争性ELISA、Western-blot和免疫荧光检测，从而为基于该蛋白临床检测方法的建立及该蛋白功能的研究奠定坚实的基础。

发明内容

本发明的目的是针对目前狂犬病严重危害人类健康，且防治过程中依然存在各种难处的现状，而提供一种能与狂犬病病毒中的磷蛋白特异性结合的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞。本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体与狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病原体无交叉反应，具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测狂犬病毒疫苗或感染组织中的磷蛋白成分的含量，具有良好的应用前景。

本发明的杂交瘤细胞株1A4已于2016年12年12日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2016194。

本发明另一目的是提供一种由上述杂交瘤细胞株1A4产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。