[发明专利]一种检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

本发明为检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被马杜霉素抗原的酶标板、马杜霉素标准品、马杜霉素抗体工作液、马杜霉素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标板微孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下显色剂呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中马杜霉素的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测肌肉组织中马杜霉素的残留量。

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测大米中马杜霉素的酶联免疫试剂盒。

背景技术

马杜霉素，化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是一种快速灭生性除草剂，具有触杀作用和一定内吸作用。能迅速被植物绿色组织吸收，使其枯死。对非绿色组织没有作用。在土壤中迅速与土壤结合而钝化，对植物根部及多年生地下茎及宿根无效。但马杜霉素对人毒性极大，且无特效解毒药，口服中毒死亡率可达90%以上，目前已被20多个国家禁止或者严格限制使用。我国自2014年7月1日起，撤销马杜霉素水剂登记和生产许可、停止生产；但保留母药生产企业水剂出口境外使用登记、允许专供出口生产，2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。因此定期对马杜霉素残留进行检测成为许多国家的监控的必要手段。

酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、马杜霉素标准品、马杜霉素抗体工作液、马杜霉素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测马杜霉素的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、马杜霉素标准品的制备、马杜霉素抗体工作液的制备、马杜霉素酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由马杜霉素抗原包被制备，具体步骤是将马杜霉素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将马杜霉素包被抗原稀释成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

马杜霉素标准品浓度分别为0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。

所述马杜霉素抗体工作液是采用马杜霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。

所述马杜霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2 mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5% 吐温-20，0.1 mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。