[发明专利]双齿围沙蚕Gα重组蛋白、多克隆抗体及Gα蛋白ELISA检测方法

权利要求书

1.一种双齿围沙蚕Gα重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

步骤1. 提取双齿围沙蚕总RNA，合成cDNA第一链；

步骤2. 以双齿围沙蚕cDNA第一链为模板，进行PCR扩增反应，所述PCR反应的上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

步骤3. 对扩增产物1061bp切胶回收，将回收目的片段与pMD18-T连接，构建克隆质粒pMD18-T-Gα，将克隆质粒pMD18-T-Gα切胶回收后转化到感受态细胞DH5α中，挑取单克隆；

步骤4. 将单克隆转到5ml Amp 100μg/mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm 震荡过夜培养，抽提重组质粒pMD18-T-Gα；

步骤5. 用限制性内切酶BamH和Xho 分别消化重组质粒pMD18-T-Gα和质粒pET-28a，并切胶回收Gα目的片段与质粒pET-28a，将回收的Gα目的片段与质粒pET-28a按照摩尔比2.25：1的比例，以T4 DNA连接酶，16℃连接14h；切胶回收重组质粒pET-28a-Gα后转化到感受态细胞DH5α中，挑取单克隆；

步骤6. 将单克隆转到5ml Kan 100μg/mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm震荡过夜培养，抽提重组质粒pET-28a-Gα；

步骤7. 将重组质粒pET-28a-Gα转化到感受态细胞BL21（DE3）中，挑取平板中单一圆滑菌落于5ml Kan 40μg/mL LB液体培养基中，37℃，200rpm，震荡培养12~16h，从培养好的菌液中吸取4ml加入到200ml灭菌的Kan 40μg/mL LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养至OD_600nm在0.5~0.6；加入IPTG，使IPTG的终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，37℃，200rpm继续震荡培养4h，收集菌液；菌液于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体；将所收集的菌体用PBS按照体积比5:1的比例清洗，4℃，12000rpm离心5min，共清洗2次，收集菌体；然后用含有1%Triton X-100的PBS对菌体进行重悬，重悬后进行超声波破碎，破碎后4℃，12000rpm离心30min弃去上清，沉淀用15ml PBS重悬，4℃保存；

步骤8. 按照每100ml培养基所得菌体加入15ml洗涤液重悬沉淀，洗涤5min，4℃，12000rpm离心20min，共洗涤2次；再按照每100ml培养基所得菌体加入10ml变性液重悬沉淀，于4℃冰箱中过夜反应，直至变性液澄清，4℃，12000rpm离心20min，取上清于-20℃保存；所述洗涤液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，2M尿素，pH7.9；所述变性液：0.5M NaCl，20mMTris-HCl，8M尿素，pH7.9；

步骤9. 选用Ni-NAT预装柱采用咪唑梯度纯化的方式对所得上清进行纯化，

用1.5ml离心管收集洗脱缓冲液洗脱的目的蛋白，所用试剂的配制体系如下：

结合缓冲液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，20mM咪唑，8M尿素，pH7.9；

漂洗缓冲液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，80mM咪唑，8M尿素，pH7.9；

0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，100mM咪唑，8M尿素，pH7.9；

洗脱缓冲液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，8M尿素，pH7.9；

步骤10. 将纯化的蛋白收集起来，利用透析袋，采用梯度复性的方法进行蛋白复性：将装有纯化蛋白的透析袋放入2L复性缓冲液中，复性缓冲液按尿素浓度的不同，共设置5个浓度梯度，缓冲液的体系为：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，尿素6M，4M，2M，1M，0M，pH7.9，4℃磁力搅拌，透析8h；一个梯度透析之后再放入到下一梯度的透析缓冲液中透析，直到透析完成，收集蛋白，4℃，12000g离心15min，收集上清弃去沉淀。