[发明专利]一种鱼精蛋白‑去氧胆酸纳米复合物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物的制备方法。

背景技术

肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，作为抗凝血药己广泛应用于临床。此外，肝素还具有抗平滑肌细胞增殖、抗炎、抗肿瘤及抗病毒等多种生物活性，尤其在改善肿瘤患者生活质量、提高生存期等方面起着积极作用¨'2肝素。研究表明，肝素能与细胞外基质中的各种生物活性分子结合：如与血管生长因子结合后能明显抑制血管的生成，从而抑瘤细胞的生长；与选择素、整合素和(或)趋化因子结合而阻断肿瘤细胞与血管内皮细胞、血小板的相互黏附，从而影响肿瘤细胞的转移¨肝素。此外，Berry等报道游离肝素分子在细胞内能与转录因子结合，使转录因子无法发挥作用，从而直接诱导肿瘤细胞的凋亡。然而，由于其特殊的硫酸化图案，肝素自身很难直接通过细胞膜进入细胞内。因此，实现游离肝素向细胞内的有效传递将有助于其更好地发挥细胞内促凋亡的作用，从而拓宽肝素在肿瘤治疗领域的应用。肝素的生物学活性有赖于其负载高密度负电荷的糖链结构，亦是其难以直接进入细胞内的主要原因。

发明内容

本发明提出一种鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物的制备方法。

一种鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）取鱼精蛋白、DOCA、钠盐、四唑蓝备用；

（2）将DOCA肝素3．54肝素g、二环己基碳二亚胺(DCC)2．40肝素g和Ⅳ．羟基琥珀酰亚胺(NHS)1．48肝素g混合；

（3）加入THF肝素30肝素ml制得悬浊液，于室温、氮气保护下搅拌反应12肝素h，过滤去除产生的白色沉淀(二环己基脲)，滤液经过量正丁烷洗涤，沉淀，得羧基被活化的DOCA，即琥珀酰化去氧胆酸；

（4）将鱼精蛋白5肝素g溶于含8肝素mol／L的硼酸缓冲液中，加入步骤（2）所述琥珀酰化去氧胆酸，以及摩尔量分别为鱼精蛋白的5-15倍的THF溶液30ml；

（5）在25℃反应1．5肝素h，反应结束后，用乙醚洗涤、超纯水透析，经过冷冻干燥后得到白色粉末状固体，即为鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物。

优选地，所述硼酸缓冲液pH9，加入量是70肝素ml。

优选地，所述THF溶液的摩尔量为鱼精蛋白的10倍。

本发明所述方法制备的鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物，经过疏水修饰后，可有效增强载体与细胞膜的融合能力，从而提高载体携带DNA或药物进入细胞的效率，本发明所述方法步骤简单，可工业化生产，实用性强。

具体实施方式

实施例1。

一种鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

（4）取鱼精蛋白、DOCA、钠盐、四唑蓝备用；

（5）将DOCA肝素3．54肝素g、二环己基碳二亚胺(DCC)2．40肝素g和Ⅳ．羟基琥珀酰亚胺(NHS)1．48肝素g混合；

（6）加入THF肝素30肝素ml制得悬浊液，于室温、氮气保护下搅拌反应12肝素h，过滤去除产生的白色沉淀(二环己基脲)，滤液经过量正丁烷洗涤，沉淀，得羧基被活化的DOCA，即琥珀酰化去氧胆酸；

（4）将鱼精蛋白5肝素g溶于含8肝素mol／L的硼酸缓冲液中，加入步骤（2）所述琥珀酰化去氧胆酸，以及摩尔量分别为鱼精蛋白的5-15倍的THF溶液30ml；

（5）在25℃反应1．5肝素h，反应结束后，用乙醚洗涤、超纯水透析，经过冷冻干燥后得到白色粉末状固体，即为鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物。

实施例2。

一种鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）取鱼精蛋白、DOCA、钠盐、四唑蓝备用；

（2）将DOCA肝素3．54肝素g、二环己基碳二亚胺(DCC)2．40肝素g和Ⅳ．羟基琥珀酰亚胺(NHS)1．48肝素g混合；

（3）加入THF肝素30肝素ml制得悬浊液，于室温、氮气保护下搅拌反应12肝素h，过滤去除产生的白色沉淀(二环己基脲)，滤液经过量正丁烷洗涤，沉淀，得羧基被活化的DOCA，即琥珀酰化去氧胆酸；

（4）将鱼精蛋白5肝素g溶于含8肝素mol／L的硼酸缓冲液中，加入步骤（2）所述琥珀酰化去氧胆酸，以及摩尔量分别为鱼精蛋白的5-15倍的THF溶液30ml；

（5）在25℃反应1．5肝素h，反应结束后，用乙醚洗涤、超纯水透析，经过冷冻干燥后得到白色粉末状固体，即为鱼精蛋白-去氧胆酸纳米复合物。

本实施例所述硼酸缓冲液pH9，加入量是70肝素ml。

实施例3。