[发明专利]一种基于16SrDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蔬菜加工与食品生物技术领域，具体涉及一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法。

背景技术

榨菜是中国特产，属于世界三大酱菜之一。榨菜在中国的种植面积广，产量高，是主要的腌制加工蔬菜之一。传统的榨菜盐渍多采用高盐浓度、自然发酵为主。传统的自然发酵存在耗工耗时、发酵周期长、杂菌易污染、产品风味不纯、食用安全性差等一系列应用上的弊端。榨菜盐渍的现代化，是以制作过程的可控性以及标准化、规范化及周年稳定均衡生产为代表的一种生产技术模式，其中采用纯菌接种就是其中一个重要环节，即通过人工分离盐渍蔬菜卤水中的肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌等主要菌种，经冻干、复配后制作成直投式发酵剂用于榨菜盐渍。由于直投式发酵剂具有活菌含量高(10⁹～10¹²cfu/g)、安全性好、保质期长、使用方便、避免菌种退化等特点，且利于标准化生产以及能有效抑制杂菌、缩短发酵周期、降低亚硝酸盐含量等优点，弥补了榨菜盐渍自然发酵的诸多不足，可以解决上述弊端，在传统发酵蔬菜产业中具有广阔的应用前景。

榨菜的盐渍过程是微生物的发酵过程。正是利用微生物的发酵原理，榨菜在自然发酵过程中，丰富的微生物菌群对榨菜制品的保藏和形成各自独特的风味起到很大的作用，榨菜盐渍过程中乳酸菌代谢产生的高浓度矿物质、乳酸和生物活性物质是构成泡菜独特风味的重要原因。乳酸发酵是榨菜盐渍过程中各种发酵作用种的最主要的发酵作用。主要的乳酸菌包括乳杆菌属、片球菌属、明串株菌属、链球菌属、乳球菌属。在一定程度上，盐渍榨菜的品质和风味很多程度上是由发酵过程中的乳酸菌菌群决定的。

但由于一些菌群的不可培养性或较差重复性，导致传统的分离培养方式难以全面、客观地反映榨菜盐渍过程中的菌群结构和变化，因此目前根据传统分离培养所制得的发酵剂生产的榨菜难以真正反映其风味与品质，出现了风味单一、发酵味不醇厚等问题。另外，传统微生物种类鉴定的方法一般采用表型特征鉴定，但此法存在操作步骤繁琐、工作量大、周期长、某些检测结果不稳定等问题。因此，根据不同蔬菜的发酵特性，寻找更为优良、有效的发酵剂制备方法对于传统蔬菜加工方式意义重大。

随着生物技术的飞速发展，传统的微生物鉴定方法常常难以鉴定众多的生长习性复杂的微生物，因而基于基因组序列的分子鉴定受到广泛关注。在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度(约为1540bp)，以及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。16S rDNA序列分析的一个显著特点是能及时鉴定出生长缓慢或生化反应惰性的细菌。

发明内容

本发明针对传统直投发酵剂存在发酵制品风味单一、发酵风味不醇厚等问题，提出了一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，该方法可定向筛选出主导榨菜盐渍及榨菜风味、品质的不同乳酸菌属，特异性和目标导向性强，准确度高，不必反复纯化。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

一种基于16S rDNA测序的榨菜专用直投式发酵剂定向制备方法，至少包括以下步骤：

(1)于榨菜盐渍池中取样，样品置于无菌冷冻管中，立即放入液氮中保存，然后置于超低温冰箱中，

(2)提取样品DNA并做琼脂糖凝胶电泳检测后做PCR，扩增16S rDNA，所述的PCR扩增的特异性引物的上游引物515F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)，特异性引物的下游引物907R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)，PCR扩增区域为微生物16S rDNA的V4-V5可变区域，测序前需对所述PCR产物进行回收纯化，

(3)将步骤(2)获得的PCR产物进行高通量测序并做比对分析，确定优势菌群种类与组成比例，

(4)优势菌株的定向筛选，

(5)定向筛选菌株的高密度增殖培养，

(6)离心并冷冻干燥，

将步骤(5)经高密度增值培养的菌液加入脱脂奶粉，摇匀后离心，去除上清培养液，收集试管底部菌体；收集的菌体加入冻干保护剂后做冷冻干燥，其中：菌体与冻干保护剂质量分数配比为1:3-1:2.5，

(7)将步骤(6)得到的各定向筛选和高密度增值培养的菌株冷冻干燥粉按照16S rDNA测序确定的优势菌群种类与组成比例混合，制得榨菜专用直投式发酵剂。