[发明专利]一种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法

说明书

技术领域

一种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，涉及纳米材料和分析化学领域。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)是作用于血管内皮细胞的一类糖蛋白，具有强烈的促内皮细胞增殖作用，促进新血管的形成。而肿瘤组织的生长，须依靠新生血管生成来提供足够的营养物质和氧气来维持，因此，VEGF已被认为是肿瘤标志物。对肿瘤标志物的检测有助于早期发现癌症，实现早期治疗的目的。

传统的VEGF检测方法，比如酶联免疫法，对单克隆抗体的要求较高，而且单克隆抗体的筛选是一项繁重且高耗的任务。本发明提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，其基于贵金属的等离子效应对荧光材料的荧光增强构建了上转换纳米粒子和金纳米颗粒组装体结构。上转换纳米粒子上修饰的适配体因与目标物VEGF亲和力强从而从与VEGF结合而金纳米粒子游离，使得原本由金纳米粒子所提供的等离子效应而增强的荧光信号随着目标物的增加而减弱。据此得到荧光强度与目标物VEGF浓度的标准曲线，实现VEGF浓度的检测。

发明内容

本发明的目的是提供种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法。

本发明的技术方案，一种基于种基于贵金属等离子效应增强上转换荧光结构的超灵敏检测血管内皮生长因子的方法，包括上转换纳米粒子的合成、改性和单链DNA或适配体修饰，金纳米粒子合成、包裹及单链DNA修饰、等离子体效应诱导的荧光增强组装体的组装以及VEGF传感器的构建，具体如下：

(1)上转换纳米粒子(27.1nm)合成：通过高温热解法制备NaYF₄:Yb,Tm上转换纳米颗粒。称取YCl₃·6H₂O，YbCl₃·6H₂O，TmCl₃·6H₂O(Ln：79.5mol％Y³⁺，20mol％Yb³⁺，0.5mol％Tm³⁺，共计1mmol)于100ml三口烧瓶中，加入4mL油酸以及16mL1-十八烯。缓慢搅拌并逐渐升温至160℃，保持30min，自然冷却至室温。准确称取0.1g氢氧化钠和0.148g氟化铵，溶于10mL甲醇溶液混合均匀。将上述溶液缓慢加入三口烧瓶中，升温至50℃，磁力搅拌30min。升温至80℃保持30min缓慢蒸发甲醇，脱气后，将混合液加热到300℃，反应1h。反应结束后，自然冷却到室温，用环己烷和乙醇洗涤三次，分散于5ml环己烷中待用。

(2)上转换发光纳米颗粒(UCNP)表面改性及修饰：取30mg步骤(1)中油酸包覆的NaYF4:Yb,Tm上转换纳米材料分散在5ml氯仿和甲苯混合溶液中，体积比为2:3。将其加入到10ml溶解有200mg聚丙烯酸的水溶液中，搅拌24h。离心收集沉淀，清水重复洗涤三次后重悬于10mM Tris-HCl中，等体积同浓度六等分，编号依次为UCNP1，UCNP2，UCNP3，UCNP4，UCNP5，UCNP6。分别对应加入5’端巯基修饰的单链DNA序列1，2，3，4，5，6即DNA1，DNA2，DNA3，DNA4，DNA5，DNA6，使其终浓度均为5nM；室温孵育2h后每隔1h加入NaCl溶液,至金纳米粒子溶液中盐粒子浓度为100mM为止，室温孵育过夜，离心除去未结合的单链DNA序列，以10mM Tris-HCl缓冲液重悬，形成UCNPx-DNAx(x＝1，2，3，4，5，6)待用。所用单链DNA序列如下：

DNA1:

5’-SH-TTTGCC TGG-3’；

DNA2:

5’-SH-TTTC CCT ATT AG-3’；

DNA 3:

5’-SH-TT TCG GTA AGT AGA C-3’；

DNA 4:

5’-SH-TTT GG GCT GTT CCG GGT G-3’；

DNA 5:

5’-SH-TTT GG GCT GTT CCG GGT G-3’；

DNA 6:

5’-SH-TTTGCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCC CCT-3’；