[发明专利]一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法

说明书

本发明公开了一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，适用于化妆品原料刺激性的评价，尤其适用于表面活性剂的眼刺激性评价。该方法利用受试物对细胞有刺激性时，细胞收缩，完全融合的细胞受到破坏，当荧光素作用于受损的细胞膜时根据漏出的荧光素量间接反映细胞膜的破坏程度，从而表征受试物的刺激性大小。该方法所用受试材料种群稳定，来源可靠，且融合速度快，容易形成细胞生长培养膜，为试验的稳定性提供保证；当用小鼠生细胞系统用于表面活性剂刺激性损伤评价时，与兔眼动物实验的结果相关性好。

技术领域

本发明涉及一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，适用于化妆品原料刺激性的评价，尤其适用于表面活性剂的眼刺激性评价。

背景技术

表面活性剂是一种重要的精细化工产品，在国内外被广泛应用，它被誉为“工业味精”，能使溶液表面张力显著下降。表面活性剂广泛应用于化妆品调制、食品加工、农药和医药加工、纺织印染及洗涤剂生产等许多工业领域。表面活性剂用于生产化妆品或洗涤剂时，与消费者眼睛接触的几率大大增加，往往对消费者的眼睛存在一定刺激性甚至腐蚀性。

家兔眼刺激试验(Draize test)是检测化学物眼刺激性的经典方法，近年来，随着实验动物使用3R原则的倡导与实施以及生物医学研究模式的转变，替代动物实验的体外模型研究已经成为毒理学评价的趋势。根据体内眼损伤发生的机理，目前尚在开发的眼刺激替代方法可分为细胞系统、鸡胚、人工角膜和离体器官四类，与其它三类相比，细胞系统标准化程度最高、成本最低而且快速。细胞系统替代内动物实验的原理是基于大多数具有眼刺激作用的物质也具有细胞毒性，因此可根据化学物质对细胞膜损伤和对细胞质内蛋白质大分子破坏的相关性建立体外方法。用于体外测试的细胞包括成纤维细胞、血细胞、犬肾细胞等，目前基于标准化实验动物小鼠肾细胞系统建立的体外方法还未见相关专利和文献报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，该方法准确性高、快速、简便、成本低、对检测仪器无特殊要求。

本发明所提供的利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，是通过检测暴露于受试物后荧光素钠漏出单/多层小鼠肾细胞的荧光素量来评价受试物的刺激性。其中，用于定量评价受试物对小鼠肾细胞损伤的指标为荧光素漏出量，其可用荧光分光光度计(激发光波长485nm，发射光波长530nm)定量测定。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，包括以下步骤：

一、小鼠肾细胞的制备

取小鼠肾脏上皮，剪碎，研磨后用培养液冲洗，收集液体，经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾细胞，加1g/L胶原酶I消化培养，37℃消化，每隔5min振荡1次，15min后加等体积含有10％牛胎血清的培养液终止消化，吹打分散细胞后静置5min，1000r/min离心5min，去除上清液，加入含10％牛胎血清的培养液，置于培养箱培养(37℃、5％CO₂)至细胞长满培养皿的85％以上，消化、冻存备用；

二、小鼠肾细胞生长培养膜的制备

取步骤一中冻存备用的对数生长期的小鼠肾细胞，调节细胞浓度为4×10⁵～10×10⁵个/mL，取0.5mL加入到插入式培养皿中的微孔滤膜表面上培养72～96h(37℃、5％CO₂)，待细胞完全融合(细胞铺满整个微孔滤膜表面)后，得到小鼠肾细胞生长培养膜；

三、荧光素渗漏试验

3.1检测范围确定实验