[发明专利]一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K2的方法

权利要求书

1.一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K₂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)维生素K₂萃取液的获取

以纳豆芽孢杆菌发酵液为维生素K₂提取原液，离心获取菌体，烘干后，采用第一有机溶剂进行萃取以获取维生素K₂萃取液；

(2)维生素K₂上柱原液的获取

将维生素K₂萃取液通过膜分离设备除去不溶性杂质，将获得的维生素K₂滤液蒸干，然后以极性有机溶剂重溶，获取维生素K₂上柱原液；

(3)低纯度的维生素K₂浓缩液的获取

将维生素K₂上柱原液通过大孔吸附树脂柱吸附，采用湿法或干法上柱，然后以第二有机溶剂清洗，最后用第三有机溶剂进行洗脱，收集相应洗脱液并对其进行浓缩，从而获取低纯度的维生素K₂浓缩液；

(4)较高纯度的维生素K₂浓缩液的获取

将低纯度的维生素K₂浓缩液经过分子量排阻层析柱纯化，然后以第四有机溶剂进行洗脱，收集相应洗脱液并对其进行浓缩，从而获取较高纯度的维生素K₂浓缩液；

(5)高纯度的维生素K₂的获取

将较高纯度的维生素K₂浓缩液溶解于第五有机溶剂后，通过反相硅胶柱分离，然后用第六有机溶剂洗脱并分段收集，即可获得高纯度的维生素K₂；

(6)维生素K₂晶体的获取

以第七有机溶剂将维生素K₂高温溶解，低温结晶，并重结晶，即可获得维生素K₂晶体；

所述用于萃取的第一有机溶剂为乙醇、正丁醇、乙酸、二氯甲烷、异戊醇、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氯化碳、丙酮、乙醚、甲苯中的一种或多种的混合液。

2.根据权利要求1所述的一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K₂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中萃取条件为：萃取方式为静置萃取或者搅拌萃取，萃取时间20min-60min，萃取次数为1-3次。

3.根据权利要求1所述的一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K₂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中膜分离设备的膜孔径≤0.45μm，所述极性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、丙酮、水中的一种或几种的混合液。

4.根据权利要求1所述的一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K₂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中大孔吸附树脂为非极性和/或弱极性大孔吸附树脂，所述上柱条件为：高径比为3-10:1，流速为0.025-0.110倍柱体积/min。

5.根据权利要求1所述的一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K₂的方法，其特征在于，所述步骤(4)中分子量排阻层析填料所排阻的物质的分子量为400Da-1000Da；所述填料可分别做柱或分几段装于同一个分子量排阻层析柱中，层析液按照填料排阻极限由小到大或由大到小的顺序依次经过柱填料；所述分子量排阻层析柱高径比为10-25:1，流速为0.004-0.010倍柱体积/min，层析柱高度与维生素K₂浓缩液上液高度比为35-50:1。

6.根据权利要求1所述的一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素K₂的方法，其特征在于，所述步骤(3)中第二有机溶剂为极性有机溶剂，用量为大孔吸附树脂柱柱体积的1-3倍；所述第三有机溶剂为二氯甲烷、正丁醇、异丁醇、甲苯、庚烷、环戊烷、环己烷、正己烷、石油醚、正戊烷、异戊烷中的一种或几种的混合液，用量为柱体积的1-4倍；所述步骤(4)中第四有机溶剂为苯、甲苯、四氯化碳、二甲基甲酰胺、酮类、二氯甲烷、二氯代苯、四氯乙烯、四氢呋喃和三氯代苯中的一种或几种的混合液，其用量为分子量排阻层析柱柱体积的1-4倍。