[发明专利]一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法

说明书

本发明涉及一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，选取三阴性乳腺癌细胞株MDA‑MB‑231及人脐静脉内皮细胞HUVEC，设置实验组：MDA‑MB‑231和HUVEC共培养组、对照组：MDA‑MB‑231单独培养组；将实验组和对照组均应用10ng/ml TGF‑β刺激36小时后，应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组中细胞上清中分泌蛋白的差异表达，比较SERPINE(PAI‑1)因子在共培养组和单独培养组的分泌结果。三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换的过程中三阴性乳腺癌细胞株能够促进内皮细胞分泌趋化因子CCL5，从而促进三阴性乳腺癌细胞的转移。

技术领域

本发明涉及分子生物领域，具体涉及一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)患者预后差，肿瘤侵袭性强，易发生局部复发及远处转移。上皮间质转换(EMT)是指上皮细胞在形态上发生向间质细胞表型的转变并获得迁移的能力。既往对三阴性乳腺癌细胞在上皮间质转换过程中与内皮细胞之间的关系并无相关研究。故而，本发明涉及了三阴性乳腺癌细胞在上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能的影响的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种三阴性乳腺癌细胞上皮间质转换过程中对内皮细胞分泌功能影响的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

选取三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC，设置实验组：MDA-MB-231和HUVEC共培养组、对照组：MDA-MB-231单独培养组；

将实验组和对照组均应用10ng/ml TGF-β刺激36小时后，应用TMT定量蛋白质组表达谱分析两组中细胞上清中分泌蛋白的差异表达，比较SERPINE1(PAI-1)因子在共培养组和单独培养组的分泌结果。

在细胞培养皿中分别单独培养三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的单独培养组，以及三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231及人脐静脉内皮细胞HUVEC的共培养组，所述的共培养组采用小室上下室共培养。

上室接种HUVEC细胞，下室接种MDA-MB-231细胞。

在单独培养组和共培养组的细胞培养皿添加10ng/ml TGF-β刺激36小时后，收集两组细胞上清，加入缓冲液，漩涡震荡60min，-20度保存。

对单独培养组和共培养组两组细胞上清进行TMT定量蛋白质组表达谱分析，具体步骤为：样品处理；强阳离子交换色谱分离样品；C18反相色谱除盐，进行肽段的纯化；质谱检测。

所述的样品处理包括：

(a)上清加入DTT至终浓度10mM；56度水浴1h；取出后，迅速加入IAM至终浓度55mM，暗室静置1h；

(b)加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20度沉淀3h以上，离心20min，取沉淀；加入300ul的复溶缓冲液，超声3min助溶；

(c)使用bradford法对蛋白进行定量每个样品取100ug蛋白体积，用含0.1％SDS的TEAB补齐所有样品体积；

(d)加入1ug/ul的Trypsin，每100ug蛋白质底物加入3.3ug的酶，37度水浴24h，然后补加Trypsin 1ug，37度12h；

(e)冻干消化液，然后使用TEAB(水：TEAB＝1:1，含0.1％SDS)每管30ul复溶肽段,取1ul消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof检测消化效率。