[发明专利]一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法

说明书

本发明提供了一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体的方法，属于植物倍性育种技术领域。本发明利用不定芽诱导培养基对倍性嵌合体植物的叶片进行不定芽诱导，对同一个体植株叶片再生的不定芽利用流式细胞仪进行倍性检测，筛选分离出不同倍性纯合体的不定芽，并分别进行再生培养，获得不同倍性的纯合体植株。本发明方法解决了木本植物体细胞染色体加倍获得嵌合体的纯化问题，并可快速、高效地构建全同胞或异同胞二倍体、四倍体或其他倍性纯合体的异细胞型植株群体，为开展多倍体育种和倍性效应遗传分析奠定了基础。

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，具体地，涉及一种从倍性嵌合体植物中分离纯合体以及建立全同胞或异同胞细胞型群体的方法。

背景技术

多倍体育种是植物遗传改良的重要手段，尤其对于异花授粉的木本植物而言，多倍体育种综合了倍性优势和杂合优势，改良效果显著(康向阳.关于杨树多倍体育种的几点认识.北京林业大学学报,2010,32(5):149-153)。三倍体毛白杨、四倍体刺槐等多倍体品种在生长量、木材品质、代谢产物含量等方面均表现出了显著的优势，已在我国林业生产中广泛应用。

四倍体植株通常通过对种子、茎尖等分生组织区施加处理诱导体细胞染色体加倍的途径获取。然而，由于植物分生组织区细胞有丝分裂的不同步性，不同细胞的加倍效果存在差异，往往导致倍性嵌合体的存在，纯四倍体的诱导率较低，影响倍性效应的发挥和育种效率。尽管Wang等通过单细胞合子染色体加倍的方式获得了杨树纯四倍体植株，并避免了嵌合体的产生，但是由于合子休眠期的存在，难以准确把握合子休眠后第一次有丝分裂的时机，因此，合子染色体加倍的四倍体诱导率也仅为3.13％(Wang J,Shi L,Song SY,TianJ,Kang XY.Tetraploid production through zygotic chromosome doubling inPopulus.Silva Fennica,2013,47(2):id932)，而且无法同时获取相同基因型的二倍体细胞型材料。此外，Cai等利用秋水仙碱处理离体培养的叶片，诱导不定芽染色体加倍也获得了杨树四倍体植株(Cai X,Kang X Y.In vitro tetraploid induction from leafexplants of Populus pseudo-simonii Kitag.Plant Cell Reports,2011,30(9):1771-1778)，但是，该方法需将材料进行同步化预培养并掌握合适的处理时机，而且不可避免的也会产生倍性嵌合体植株，同时，大量的工作量仅能完成单个基因型的四倍体诱导，试验操作步骤繁杂，试验周期长，四倍体诱导效率较低，不利于大群体四倍体植株的获得。刘孟军等在田间利用秋水仙碱处理枝条愈伤组织可获得高比率纯四倍体，但是也不能完全避免嵌合体的发生，同时还观察到了八倍体、六倍体、五倍体和三倍体的存在，而且需要经历后期发育过程的形态学鉴定(刘孟军，刘平，王玖瑞，石庆华，徐娟，宁强.枣田间愈伤组织途径免嵌合体纯化快速诱导同源多倍体.园艺学报，2013，40(S):2610)。

如能充分利用容易诱导获得的倍性嵌合体为材料，将倍性嵌合体中的四倍体细胞纯化并再生为完整植株，必将极大地提高植物四倍体育种的效率和效果，并且在可能同时纯化出相同基因型的二倍体植株，构建全同胞二倍体和四倍体异细胞型群体，满足深入开展林木倍性效应遗传分析的需要，推动林木遗传改良理论发展。Chen等对黄芪倍性嵌合体材料利用愈伤组织分化并再生的方式，实现了四倍体的纯化，但是由于愈伤组织再生过程非单细胞再生，导致同时产生了嵌合体的植株(Chen LL,Gao SL.In vitro tetraploidinduction and generation of tetraploids from mixoploids in Astragalusmembranaceus.Scientia Horticulturae,2007,112:339-344)。多次继代培养被认为可以实现嵌合体的分离纯化(向素琼，梁国鲁，郭启高，李晓林，何桥.辣木组织培养与四倍体植株诱导.热带亚热带植物学报,2007,15(2):141-146)，但是时间周期很长，而且由于不同倍性细胞发育的竞争性因素，可能导致最终仅能获得二倍体植株，因此，研发更加高效、适宜的嵌合体纯化技术十分必要。