[发明专利]大丽轮枝菌产微菌核相关基因VdGAP的功能分析及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)产微菌核相关基因VdGAP的功能分析及其潜在应用的研究，属于植物病理学研究领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是引起植物黄萎病的重要土传病原真菌，寄主广泛，可危害多种重要的经济作物和园艺作物。传统的防治技术，如轮作、抗性品种选育、化学药剂等对黄萎病的防治有一定的效果，但是由于大丽轮枝菌具有丰富的遗传多样性，致病力易发生分化，且主要以抗逆性强的微菌核结构在土壤中存活，因而在世界范围内黄萎病的危害依然严重。

黄萎病是系统性侵染的单循环病害，微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要休眠结构，能够在无寄主植物的土壤中长期存活达14年之久，成为植物黄萎病重要的初侵染来源，在病害循环中起重要作用，其形成的数量及存活情况直接影响着黄萎病的发生危害程度。因此明确微菌核形成和发育的机制对于深入研究该病害流行规律和制定防治措施具有重要意义。对于大丽轮枝菌微菌核的研究过去往往集中于微菌核的形态、大小、分布，微菌核的分离培养技术以及影响微菌核存活的土壤环境因素等。对于其发育的过程在形态学层次也已清晰，最初阶段是由单根或数根菌丝膨大，并产生大量的隔膜。然后，其隔膜的细胞继续增大，成为球状并产生侧芽。最后，在细胞壁内和细胞间沉积黑色素颗粒，黑色素对于形成完整的休眠结构是必须的。而对于其发育的分子机理则研究的很少。

目前报道的与大丽轮枝菌微菌核发育相关的基因不多，并且大多与致病性相关，其中研究最深入的是基因VDH1。通过构建大丽轮枝菌微菌核形成发育的EST文库，在1000多个EST文库中发现有29个与大丽轮枝菌微菌核形成有关。再进一步研究发现其中的class II hydrophobin基因(VDH1)参与了大丽轮枝菌微菌核的形成，该基因敲除后的突变体形成微菌核的能力大大降低，但其致病性几乎没有改变。通过与GFP融合表达，发现该基因定位于菌丝和分生孢子细胞出现融合的部位，也就是在大丽轮枝菌微菌核初始形成的阶段特异性表达，并且该基因表达受营养物质碳源的调控。另外，通过借鉴在其他病原真菌如核盘菌、立枯丝核菌菌核发育或致病性方面的研究成果，推测可能参与大丽轮枝菌微菌核发育的候选基因，通过基因敲除验证，发现了基因VMK1、VdPKAC1、VdSNF1和VGB。其中VMK1编码促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，该基因敲除后的突变体微菌核形成明显减少，致病力也显著下降。VdPKAC1编码cAMP依赖性蛋白激酶A的一个催化亚基，该基因敲除后的突变体微菌核形成显著增加，而致病力则明显降低。VdSNF1编码sucrose nonfermenting 1，该基因调控分解代谢阻遏，敲除后的突变体编码细胞壁降解酶的基 因表达下降，致病力显著下降，微菌核形成的能力也显著下降。与其他植物病原真菌相比，大丽轮枝菌微菌核发育的分子机理研究相对滞后。目前已经发现的这些基因仅仅揭开了大丽轮枝菌微菌核发育机制的冰山一角，外界环境和内在因子引发大丽轮枝菌微菌核发育的途径、靶标位点以及作用方式都还需要进一步揭示。

另外大丽轮枝菌属于半知菌，病菌在不同生态条件下形态和致病力变异很大，而且受温度、营养、菌株特性等条件的影响大。在菌落形态上，根据在PDA培养基上生长时形成微菌核的多少将大丽轮枝菌分为产生大量黑色微菌核的菌核型、产生少量黑色微菌核的中间型和不产微菌核的菌丝型这三种培养类型。从我们长期监测江苏省棉花黄萎病菌变异的结果来看，2002年调查时，菌丝型菌株在田间所占比例最高，而2008年再调查时，江苏棉花黄萎病菌已从菌丝型为主演变为菌核型为主。这种大丽轮枝菌微菌核产生的群体遗传变异规律也有待于揭示。