[发明专利]一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法

说明书

本发明公开了一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于以芦苇种子为外植体；消毒后置于诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织；然后获取胚性培养物生成完整植株；得到再生芦苇苗；将芦苇再生苗转至无菌组培瓶中加入OECD模拟废水、活性污泥孵育，取根组织消毒研磨，再将浆稀释涂布于MS平板上培养，收集菌体，清洗后制成细菌重悬液，取芦苇胚性培养物浸入细菌重悬液中孵育，再将芦苇胚性培养物进行培养。配制溶胶悬液和CaCl₂溶液，将芦苇胚性培养物加入种皮基质中，再用无菌巴氏吸管每次吸入一个芦苇胚性培养物，滴入CaCl₂溶液中，取出后清洗晾干，形成人工种子；该方法制备人工种子具有耐镉、提高种子活力和幼苗品质等优点，适合大规模推广。

技术领域

本发明涉及无性繁殖领域，具体为一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备。

背景技术

芦苇是广泛分布于世界各地、形态上高度分化的草甸与湿地植被建群种，具有重要的生态学和经济学价值。芦苇在自然环境中以根状茎繁殖为主，难以进行种子繁殖。长期大量的分株繁殖常常会导致种性的退化，从而影响植物的生活力。同时由于人类活动对生态环境的严重干扰，部分湿地重金属污染程度不容乐观。长期处于重金属污染环境中，植物的根茎存活和繁殖往往受到抑制，而导致种群衰退。所以，避免从芦苇原生地采取芦苇而保护原生地生态环境的同时，又如何轻便、快速培育具有重金属耐受性的幼苗，成为恢复芦苇种群研究的瓶颈。

植物可通过有性的和无性的两个生命发育周期来繁殖，对于很难以种子进行有性繁殖的植物种，由微胶囊包埋植物繁殖体制备而成的人工种子，可替代天然种子进行无性繁殖。常规的人工种子研制一直都是建立在植物单独存在的理念之上，即通过离体组织培养产生体细胞胚或不定芽等作为包埋繁殖体，而以植物和微生物共生体为培育材料的研究很少。植物离体组织培养一般建立和维持在无菌条件下，以降低微生物污染物对体外培养的植物材料做有害竞争。而有着生态独特性的植物内生细菌，不仅能和宿主植物协同进化，并能产生具有生物活性的代谢产物而提高植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力。因而引入特定功能的内生细菌来增强人工种子活力和品质，将具有改良植物表型的潜力；因此本发明在离体培养条件下，制备一种耐镉芦苇幼苗的人工种子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：步骤如下：

步骤一：采集成熟芦苇小穗，去内外稃，以表面无损的芦苇种子为外植体；

步骤二：将步骤一中所述的外植体消毒后，置于诱导培养基上诱导出粘性愈伤组织；

步骤三：剥取步骤二中所述的粘性愈伤组织，将所述粘性愈伤组织转置于新鲜的诱导培养基上，进一步诱导出胚性愈伤组织；

步骤四：将步骤三所述的胚性愈伤组织通过增殖培养，获取胚性培养物；

步骤五：将步骤四所述的胚性培养物转至无植物生长调节剂的再生培养基上生成完整植株；

步骤六：将步骤五中生成的完整植株进行培养，得到芦苇再生苗；

步骤七：将步骤六所述的芦苇再生苗转至无菌组培瓶中进行培养，向所述无菌组培瓶中加入无菌OECD模拟废水；采集活性污泥，将所述活性污泥离心、清洗后加入所述组培瓶中，用组培膜覆盖瓶口，将所述组培瓶于人工气候箱中孵育；

步骤八：取经步骤七处理的芦苇再生苗的根组织，将所述根组织的表面进行消毒后研磨成浆，再将所述根组织的浆标准稀释涂布于MS平板上，将所述MS平板放置在恒温培养箱中培养，待菌落长出；