[发明专利]一种筛选抗猪圆环病毒病猪的miR-122启动子区分子标记育种方法及其应用

说明书

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种猪miR‑122基因的启动子区突变位点的分子标记方法及其在猪抗猪圆环病毒病育种中的应用，发明人发现在不同品种猪中miR‑122的启动子区存在多处差异，其中－4845位点处存在7bp碱基的插入/缺失，通过荧光素酶报告基因系统发现，有7bp碱基插入的启动子荧光素酶活性显著高于7bp碱基缺失的启动子荧光素酶活性。可见通过检测猪基因组中miR‑122基因启动子区－4845位点的基因型作为与猪抗猪圆环病毒病性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种筛选抗猪圆环病毒病猪的育种方法，通过判断猪ssc-miR-122的启动子区突变位点的多态性来进行选种，并人为的应用该突变位点实现优良育种。

背景技术

自1982年Tischer等在PK15细胞中发现猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)以来，对其的研究已有约34年的历史。PCV分为无致病性的PCV1和强致病性的PCV2两种亚型。PCV2主要感染5～15周龄的猪，致死率约为15％。它是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PWMS)、呼吸道疾病综合征(PRDS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)的主要病原(Stevenson etal.,2001)。PCV2感染机体后能引起免疫抑制，在与其它病原体一同共感染或继发感染时，将会加重病情，严重的则会造成机体死亡。猪的抗病性状属于中等遗传力水平的阈性状，对病毒引起的疾病所产生的抗性是可以遗传的。Opriessnig等的研究发现，在感染PCV2后，皮特兰猪所表现出的临床症状最为严重，长白猪次之，杜洛克猪和大白猪的症状表现相对较轻。同时，本研究团队前期的研究发现在感染PCV2后，大长杂交猪表现出日增重减慢、体温升高、腹泻、皮肤出现紫斑以及肺脏和脾脏出现充血、出血等症状，而莱芜猪却表现温和，无明显病变。以上结果表明不同品种猪对PCV2的抗性存在遗传差异，地方品种猪抗PCV2的能力较强。猪不同品种间对PCV2的抗性存在遗传差异，这为抗猪圆环病毒病猪的育种提供了基础和前提。

莱芜猪具有抗病耐粗、多胎高产、哺育力强、肉质好等优良特性。调查显示，自2000年以来，在西方猪种PCV2感染率及死亡率呈逐渐升高的趋势，而我国地方品种莱芜猪未出现PCV2感染的报道，表现出对PCV2强的抗感染能力。本研究团队利用数字表达谱测序对比了抗病性强的莱芜猪和易感的大长杂交猪感染PCV2后肺脏组织表达谱的差异，筛选出大量差异表达的microRNA，实时定量RT-PCR试验验证了攻毒后的莱芜猪的肺脏中miR-122表达量显著高于未攻毒莱芜猪；而在大长杂交猪中的表达相对稳定(图1)。这提示了ssc-miR-122基因 可能与猪圆环病毒病的抗性有关。

miR-122是一种专一表达于成年人肝脏的miRNA，位于人的18号染色体上，在一个肝脏特异性表达的转录单元内，而猪miR-122位于1号染色体。miR-122是一个较长前体非编码基因转录本通过剪切后而产生，启动子具有较高的保守性，miR-122前体基因启动子区位于miR-122保守茎环序列上游约5kb处，包含多个核受体因子结合序列，如RNA聚合酶II所识别的启动子顺式元件TATA-box等，利用报告基因系统结合生物信息学分析以及序列删除和突变技术，确定了这些元件对于miR-122基因表达具有十分重要的调节作用。MiR-122有促进肿瘤细胞凋亡的作用，并可参与肝细胞发育、肝细胞表型、分化代谢和肝细胞应急应答等多种生理活动。

通过对比莱芜猪和大长杂交猪miR-122基因的启动子区系列，找到多处核苷酸序列的不同。对－4845位点存在的7bp碱基插入/缺失的多态进行了进一步研究。我们的研究表明miR-122基因－4845位点的7bp碱基缺失后，荧光素酶报告基因活性显著降低，提示该位点的7bp碱基插入可能有增强miR-122基因转录的功能。由于miR-122的稳定表达和猪抗圆环病毒病相一致，因此通过检测该分子标记，选择miR-122高表达的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗圆环病毒病特性具有重要的意义。

发明内容