[发明专利]一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法

说明书

本发明公开了一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法，该分离提取方法步骤如下：布袋式过滤‑纳滤膜过滤‑壳四糖分子印迹树脂吸附‑壳四糖分子印迹树脂洗脱‑脱除锌离子‑冷冻干燥。本发明的基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法与现有技术相比，具有分离工艺步骤简单、生产成本低、壳四糖单体纯度高、可实现规模化制备等特点。

技术领域

本发明涉及海洋壳寡糖单体分离纯化研究领域，具体地说是一种基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法。

背景技术

寡糖(oligosaccharides)及糖缀合物是生物体内重要的信息物质，在生命过程的细胞识别、信号传导和受体调节过程中扮演着极其重要的角色。壳寡糖(Chitooligosaccharides, COS)是由海洋甲壳质经脱乙酰化、降解以后得到的产物，一般是由3-10个氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成。壳寡糖分子量低能溶于水，且具有优于壳聚糖的生物活性，在保健品、生物化工材料以及食品等领域被广泛利用。目前海洋壳寡糖单体的分离制备存在如下问题：(1) 纯度低。由于壳寡糖分离纯化工艺复杂，采用分步沉降法和膜分离法等常规分离方法，难以得到高纯度的壳寡糖单体。因此，目前市售的海洋壳寡糖产品大部分都是低聚合度的壳寡糖混合物，制约了壳寡糖的高值化开发利用。(2) 产量小。目前所采用的凝胶色谱法、离子交换色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、醋酸纤维膜电泳法、高效液相色谱法和高效毛细管电泳、快速制备液相色谱仪和灌注层析等仪器分离方法只能制备少量的壳寡糖单体(通常在mg级水平)，难以实现壳寡糖单体的规模化分离制备。(3) 价格贵。目前市场上高纯度海洋壳寡糖单体(聚合度n = 4~6)是以mg级包装，价格昂贵。例如高纯度的壳四糖至壳六糖单体，销售价格1500~1600元/10mg左右。因此，高纯度的不同聚合度壳寡糖单体的规模化制备，成为制约其应用开发的技术瓶颈。寻找新的分离方法和技术，并实现其规模化制备是壳寡糖开发利用的难点问题之一。综上所述，由于壳寡糖单体(n = 4~6)之间物理化学性质和化学结构的差异性非常小，常规的分离提取技术在其提取领域进行规模化推广使用受到制约，因此，壳寡糖单体规模化分离提取困难，成为制约其应用开发的技术瓶颈。寻找新的分离方法和技术，并实现其规模化制备是壳寡糖单体开发利用的难点问题之一。

分子印迹聚合物（MIP）是一种基于分子印迹技术( MIT)的新的分离材料，主要用于复杂和预处理手续繁杂的生物或环境样品的分离、提纯和浓缩样。MIP制备方便，是一种价格低廉的高效分离材料，易于实现具有克级 (甚至千克级) 的制备规模，成为对复杂体系分离提取新兴的研究方向[1,2]。随着MIT的不断发展，近年来国内外科研工作者成功地将该技术用于海洋天然产物的分离提纯。例如，国家海洋局第一海洋研究所的王小如课题组将MIT用于海洋微生物生物碱活性成分的分离提取，取得了很好的分离效果[3]。日本学者Takuya Kubo等人[4]将MIT用于海洋贝类毒素软骨藻酸的色谱分离，从有毒贝类中提取贝类毒素软骨藻酸。为探索糖的分离和测定新方法，国内外学者又将MIT拓展到糖化学研究领域。例如，Zhiliang Cheng[5] 、Yiqun Yang[6] 和Manju[7]等将MIT与电化学分析、荧光分析等技术相结合，用于单糖的分离和测定；美国的Parmpi[8]等利用MIT制备了MIP水凝胶，用于葡萄糖等单糖的分离和识别；法国的Sineriz[9]研究团队，以葡萄糖-6-O-硫酸盐为模板，研究了MIT在葡萄糖-6-O-硫酸盐识别的应用；土耳其的Okutucu[10]等利用MIT合成了以非共价键识别模式的半乳糖MIP，用于葡萄糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和棉子糖等三糖以下糖的选择性识别，在糖的识别研究方面取得了很好的成果。MIT在糖化学领域的这些成功应用，为海洋壳寡糖单体的分离提供了重要的理论依据和技术支撑。综观国内外研究现状，模板分子大部分是三糖(例如棉子糖)以下的单糖和双糖，三糖以上寡糖的分离和识别的研究鲜见报道，而MIT在海洋壳寡糖的分离研究尚未见报。

发明内容

本发明的技术任务是提供一种生产成本低、制备的壳四糖单体产品纯度高的基于分子印迹技术的壳四糖单体分离提取方法。