[发明专利]环介导等温扩增技术检测三种泌尿生殖道支原体的方法

说明书

技术领域

本发明属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在三种人类常见泌尿生殖道感染支原体方面的应用，即解脲脲原体、生殖支原体和人型支原体的环介导等温扩增检测技术及其专用引物、检测方法和试剂盒。

背景技术

支原体 (Mycoplasma) 是介于细菌与病毒之间的一种原核细胞型微生物。迄今为止，能够导致人体感染的支原体大约有20种，其中引起人类泌尿生殖道感染的支原体主要有三种，即解脲脲原体(Ureaplasma Urealyticum, UU)、生殖支原体(Mycoplasma Genitalium, MG) 和人型支原体(Mycoplasma Hominis, MH) 。研究显示，UU、MG和MH是引起非淋菌性泌尿生殖道炎(nongonococcal urethristis, NGU)的主要病原体。在欧美国家，NGU感染已居性传播疾病之首。我国发病率NGU发病率也在不断增加，尤其是支原体混合感染情况，越来越受到人们的重视。支原体感染泌尿生殖道后能引起尿道炎、慢性前列腺炎、急性输卵管炎、子宫内膜炎等疾病，甚至导致习惯性流产和死胎。有研究报道，孕妇宫颈感染UU与不良妊娠结局发生有显著关联，与胎膜早破、早产、新生儿窒息和新生儿肺炎等密切相关。此外，UU、MG和MH感染后还可能导致不孕不育。一方面，支原体通过黏附精子而阻碍精子的运动；另一方面，支原体能产生神经氨酸酶样物质干扰精子和卵子的结合；此外，支原体与精子膜有共同抗原，对精子可造成免疫损伤而导致不孕症。因此，在特定地区、对特定人群泌尿生殖道支原体感染情况进行持续监测对于这种性传播疾病的防治具有重要意义。

泌尿生殖道支原体感染所表现出的临床症状常常不典型，实验室病原学检查对辅助医生下诊断具有重要意义。目前支原体的实验室诊断金标准为分离培养，但分离培养法通常存在两个弊端，一是检测时间过长，固体平板生长出典型菌落至少需要3周时间。二是分离培养难度大，某些支原体（如MG）对营养要求苛刻，临床标本的分离培养不易成功，容易造成假阴性的结果。尽管指示细胞培养法能大大缩短分离培养所需时间，但培养过程中菌株容易死亡，亦不适用于临床快速检测。血清学方法在临床上广泛使用，尽管一些商品化试剂盒市面有售，但各试剂盒的包被抗原不同以及临界值设定不同导致各试剂盒的特异性和敏感性存在差异。此外，血样的采集时间和患者年龄对依赖血清学方法的实验室诊断影响较大，而某些支原体在血清学上又存在交叉反应性。免疫荧光法灵敏度高于ELISA，但操作繁琐、成本较高、自动化程度低。核酸染色法容易受到细菌污染的干扰，且需要一定经验来辨别支原体。PCR的出现虽克服了传统实验敏感度低的弊端，但却存在非特异性的问题，且不适用于基层单位、现场监测和床旁检测。因此，开发一种针对常见泌尿生殖道支原体的即时检验方法成为了临床和实验室中亟待解决的问题。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型等温核酸扩增技术，它具有简便、快速、经济、灵敏等优点，近年来发展迅速，已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计2对引物（FIP[F1c+F2]、BIP[B2+B1c]、F3、B3，图1），在链置换型DNA聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内（15~60 min）进行核酸扩增。在DNA扩增反应中，当一个dNTP分子结合到DNA链上时会解离下一个焦磷酸根离子，后者与镁离子结合形成大量副产物焦磷酸镁，反应结果无需电泳检测，肉眼可见白色沉淀，加入荧光染料后可观察到绿色荧光。与传统PCR相比，LAMP 具有操作简便、灵敏度高、特异性强，判定简单，成本低廉等特点。其检测灵敏度至少高于普通PCR 2个数量级。此外，等温扩增仅需一个水浴锅或恒温装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。LAMP反应结果的检测不需要像普通PCR 进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光即可，是一种简便、快捷、高通量的检测方法。