[发明专利]抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法及其应用

权利要求书

1.抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S100、制备杂交瘤细胞：将抗伪狂犬病毒经过小鼠免疫和细胞融合，制得可分泌抗伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞；

S200、可变区序列与恒定区序列的克隆：提取所述杂交瘤细胞的总RNA，反转录制备cDNA，分别扩增鼠源抗体可变区的轻链、重链的序列；取淋巴细胞提取其总RNA，反转录制备cDNA，分别扩增猪源抗体恒定区轻链、重链序列；

S300、轻链与重链全长基因的克隆：重叠延伸所述鼠源抗体可变区轻链和所述猪源抗体恒定区轻链，获得鼠-猪嵌合轻链全长基因序列；重叠延伸所述鼠源抗体可变区重链和所述猪源抗体恒定区重链，获得鼠-猪嵌合重链全长基因序列；

S400、制备抗伪狂犬病毒猪源化单抗：将所述鼠-猪嵌合轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合重链全长基因序列克隆于基因载体，扩增后纯化获得基因型抗伪狂犬病毒猪源化单抗；或者，将所述鼠-猪嵌合轻链全长基因序列和所述鼠-猪嵌合重链全长基因序列克隆于表达载体并在表达系统中表达，获得蛋白型抗伪狂犬病毒猪源化单抗。

2.根据权利要求1所述的抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法，其特征在于，所述步骤S100包括如下步骤：

S101、伪狂犬病毒变异株的培养、纯化：在国内规模种猪场采集猪伪狂犬病毒变异株，接种BHK-21细胞培养60h后取细胞瓶置于-20℃冰箱冷冻，常温融化，反复冻融3次后收集病毒液；

S102、免疫和细胞融合以及制备杂交瘤细胞：取纯化后的伪狂犬变异病毒液，PBS稀释后用于小鼠免疫，分离免疫小鼠脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，制得杂交瘤细胞。

3.根据权利要求2所述的抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法，其特征在于，所述步骤S102中所述小鼠免疫采用长周期的免疫方法，具体包括：6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用伪狂犬变异病毒液50-100μg按1:1与完全福氏佐剂混匀，腹腔或背部多点注射；2周后，用伪狂犬变异病毒液50-100μg按1:1与不完全福氏佐剂混匀，腹腔或背部多点注射进行二免；隔2周再用伪狂犬变异病毒液50-100μg按1:1与不完全福氏佐剂混匀，腹腔或背部多点注射，进行三免。

4.根据权利要求2所述的抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法，其特征在于，所述步骤S102中所述小鼠免疫采用短周期的免疫方法，具体包括：取高压PBS溶解伪狂犬变异病毒液至50-100μg/mL，与等量FCA混合，充分乳化后免疫6周龄BALB/c小鼠3只/组，免疫2组，免疫剂量为每只0.1-0.5mL，免疫方式为背部皮下多点注射；以间接ELISA、间接竞争ELISA挑选效价最高、IC50最低的小鼠为细胞融合备用鼠，采用50μg/只的免疫剂量进行腹腔注射式超强免疫。

5.根据权利要求1所述的抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法，其特征在于，所述步骤S100中，所述抗伪狂犬病毒单克隆抗体为如下中的至少一种：抗伪狂犬病毒糖蛋白gIII的单克隆抗体、抗伪狂犬病毒糖蛋白GP50的单克隆抗体、抗伪狂犬病毒糖蛋白gE的单克隆抗体、抗伪狂犬病毒糖蛋白gB的单克隆抗体、抗伪狂犬病毒糖蛋白gH的单克隆抗体、抗伪狂犬病毒糖蛋白gD的单克隆抗体。