[发明专利]一种改进的转氨酶及其在(R)-3-氨基丁醇制备上的应用

说明书

本发明涉及一种改进的转氨酶、编码基因及其在(R)‑3‑氨基丁醇制备上的应用。该改进的转氨酶的酶活性高于野生型转氨酶的酶活性，野生型转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，来源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624，改进的转氨酶包含与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性的氨基酸序列，且对应于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第215位为脯氨酸残基。其中改进的转氨酶用于制备(R)‑3‑氨基丁醇的反应条件温和，产物手性纯度及收率均较高，底物浓度高达50g/L，具有较好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种改进的转氨酶、编码基因及其在(R)-3-氨基丁醇制备上的应用。

背景技术

(R)-3-氨基丁醇在化学反应和药物合成方面有着广泛的应用，可作为多种手性药物的关键中间体。比如抗HIV药物度鲁特韦(Dolutegravir)，该药由葛兰素史克(GSK)研发生产，2013年8月12日获美国食品和药物管理局(FDA)批准上市。度鲁特韦自上市以来销售额呈现飞跃式发展，2015年度全球销售额高达90亿美元。

(R)-3-氨基丁醇常温常压下是一种无色黏稠液体，分子量为89.14，可溶于水、乙醇、乙酸乙酯等溶剂中，其结构式如下所示：

目前公布的(R)-3-氨基丁醇的合成方法以化学法为主，一种是采用动力学拆分法获得手性纯的3-氨基丁醇(Journal of Organic Chemistry,42,1650,1977)，该方法产品收率低，反应过程采用四氢铝锂作为还原剂，工业化放大生产较危险。另一种是以手性化合物作为起始原料，如D-丙氨酸或R型苯乙胺通过多步反应获得手性纯的3-氨基丁醇(Tetrahedron,61,9031,2005和CN 101417954B)，这一类方法中手性纯原料价格较贵，且反应步骤冗长，生产成本较高。

与化学合成法相比，生物合成法具有反应条件温和、转化率高和立体选择性强等优点，目前利用生物法制备(R)-3-氨基丁醇的报道还较少。转氨酶能够不对称催化潜手性酮类化合物一步合成手性胺类化合物，具有较好的应用前景。专利CN 104131048A公开了一种利用野生型D-转氨酶不对称催化4-羟基-2丁酮合成(R)-3-氨基丁醇的方法，但其反应底物浓度最高仅为300mM(26.4g/L)，无法满足工业化生产需求，仅停留在实验室研究阶段，同时反应过程中需使用10％的有机助溶剂DMSO或乙腈，这也增加了反应后处理的操作和成本，工业三废排放量加大。

发明内容

为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明提供了一种改进的转氨酶，同时还公开了该转氨酶的编码基因、重组表达基因工程菌及其在(R)-3-氨基丁醇制备上的应用。

本发明第一方面提供了一种改进的转氨酶，其酶活性高于野生型转氨酶的酶活性。

所述酶活性是指催化酮类化合物发生不对称转氨反应生成手性胺的酶活性。

所述野生型转氨酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，且来源于土曲霉菌Aspergillus terreus NIH2624。

在本发明的一个具体实施例中，所述酶活性是指催化底物4-羟基-2-丁酮发生不对称转氨反应生成(R)-3-氨基丁醇的酶活性。

所述改进的转氨酶是在SEQ ID No.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有转氨酶催化活性的蛋白质，且与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少95％序列同源性。其中，所述的“几个”是指2-15个，更佳地小于10个。根据本发明，在如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质分子中进行2、5、10个氨基酸残基的突变得到SEQ ID No.4、6、8所示氨基酸序列的蛋白质均具有较高的转氨酶的活性。