[发明专利]一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的嗅觉活性剂筛选方法

权利要求书

1.基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；

2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT-PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；

3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；

4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；

5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数K_D低于20μmol/L以下时，确定为适合中华蜜蜂的植物花香气味嗅觉活性剂。

2.如权利要求1所述的一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于所述的步骤4)中IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0.5mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为5h。

3.如权利要求1所述的一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于所述的步骤5)中竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味挥发物的结合反应谱的工艺步骤包括：

1)荧光配基1-NPN与中华蜜蜂重组气味结合蛋白的结合

在281nm激发波长下，向1μmol/L的中华蜜蜂重组气味结合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀；

2)配基结合和EAG验证

选取中华蜜蜂植物花香气味物质和1-NPN进行竞争结合中华蜜蜂重组气味结合蛋白，如果中华蜜蜂植物花香气味物质将1-NPN与AcerOBP2相对荧光值竞争至50％以下，并且解离常数K_D低于20μmol/L以下时，则确定为适合中华蜜蜂的嗅觉引诱活性剂。