[发明专利]高香草酸均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法

权利要求书

1.一种高香草酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将抗高香草酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗高香草酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:300～1:6000；

(2)试剂B：将高香草酸酶标偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，高香草酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:300～1:8000；

所述高香草酸均相酶免疫检测试剂，含有抗高香草酸特异性抗体和酶试剂，所述的酶试剂由高香草酸酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；

所述的抗高香草酸特异性抗体由高香草酸免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与高香草酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；

所述的高香草酸免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；

其中，高香草酸酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：

(a)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg 0.05M Tris、8mg 3.3mM MgCl₂和100mg NaCl的溶液中，pH＝8.5～9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖-6-磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇；加热到30-35摄氏度，再一次性加入1～3mL二甲基亚砜，摇匀后静置5-15s；

(b)高香草酸的激活：在无水状态下称取5～15mg高香草酸，溶解于300～900μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-10～-14℃；加入1.5～4.5μL三丁胺；加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；加入0.1～2μL碳二亚胺EDC；5～15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺；-10～-14℃搅拌30～60分钟；

(c)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与高香草酸的连接：将步骤(b)激活的温度为-9～-10℃的高香草酸溶液逐滴加入到步骤(a)溶解的温度为30-35摄氏度的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；

(d)纯化产物。

2.一种如权利要求1所述的高香草酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的高香草酸免疫原的制备步骤如下：

①将载体蛋白100～300g溶解于25～75mL 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；

②将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：100～300mg高香草酸、1.75～5.25mL二甲基甲酰胺、1.75～5.25mL乙醇、3.5～10.5mL 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、100～300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，将上述化学品在室温下搅拌溶解反应30～60min；

③将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到高香草酸免疫原。

3.一种如权利要求1-2中任一项所述的高香草酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于：抗高香草酸特异性抗体的制备过程包含以下步骤：

(Ⅰ)用PBS将高香草酸免疫原稀释至0.1～3.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用0.5～5.0mL抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

(Ⅱ)2～3周后，再用0.5～5.0mL相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射3～6次；

(Ⅲ)对步骤(Ⅱ)的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000～1:50000的抗高香草酸特异性抗体。

4.一种如权利要求1所述的高香草酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于：

纯化产物的具体步骤为：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。