[发明专利]一种能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的多功能酿酒酵母

说明书

本发明公开了一种能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的多功能酿酒酵母，该重组酿酒酵母中含有能利用能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有降解纤维素的酶基因和抗菌肽基因。本发明基因重组酿酒酵母能够同时分泌纤维降解的相关酶以及抗菌肽，纤维素降解酶可以补充个内源性纤维素酶的缺乏或不足，通过纤维素降解酶基因间的有机搭配，能够在酶适宜条件下对天然纤维素进行降解生产纤维寡糖，从而能促进益生菌的生长等。抗菌肽针对杂菌或致病菌，同时抗菌肽能够促进机体的免疫力提高，促进机体的生长，从而在饲料添加、餐厨废弃物等等应用领域发挥作用。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程等领域，更具体地，涉及一种能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的多功能酿酒酵母。

背景技术

纤维素是世界上最丰富的可再生资源，开发和利用纤维素能够有效地促进我国畜牧业可持续发展的。除反刍动物瘤胃微生物可发酵利用纤维素外，其他家畜本身缺乏纤维素酶(cellulase)，对纤维素不能有效利用或利用率低。此外，纤维素降解产物之一纤维寡糖(cello-oligosaccharide，COS)，是一种新型的功能性寡糖，由2～7个吡喃型葡萄糖单元以β-1，4-糖苷键连接而成。纤维寡糖一般可以通过纤维素降解而制备。利用农业副产物例如秸秆、甘蔗渣等纤维素来源来生产纤维寡糖将具有较高的环境效益和经济效益。

纤维素酶及其代谢产物纤维寡糖等具有以下作用：①补充动物内源酶的不足，刺激酶分泌，例如在草食动物中的纤维素酶量不足，会使粗纤维的消化吸收受到限制，补充外源纤维素酶后可以得到改善。②与其他酶类协同作用，破坏植物细胞壁，促进营养物质吸收利用。纤维素酶可与半纤维素酶、果胶酶等协同作用，破坏植物的细胞壁，使胞内的淀粉酶和蛋白酶释放，利于动物消化吸收。③消除非淀粉多糖类抗营养因子，提高营养价值；④提高机体的代谢水平，增强免疫力，例如维持小肠绒毛形态完整性⑤改善动物微生态环境。纤维寡糖可促进有益微生物的生长，增加单细胞蛋白的含量。因而，通过对纤维素酶的研究是纤维素作为饲料开发和利用的关键。

抗菌肽(antimicrobial peptide)这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽抑制致病菌生长，不同抗菌肽对细菌、真菌、原虫以及病毒等具有不同杀伤能力；抗菌肽还具有选择性免疫激活和调节功能。

本发明通过酿酒酵母系统将纤维素酶基因和抗菌肽基因共表达，实现纤维素酶和抗菌肽分泌表达。其中，将纤维素降解基因中内切β-1,4-葡聚糖酶基因、外切β-1,4-葡聚糖酶基因、β-葡聚糖酶基因，按照以内切β-1,4-葡聚糖酶基因和外切β-1,4-葡聚糖酶基因或β-葡聚糖酶基因的俩俩搭配，实现纤维寡糖的最大化，减少纤维素生产葡萄糖的量。将重组酿酒酵母应用到饲料添加、动物养殖以及餐厨废弃物降解中，可以有效发挥其协同作用，发挥益生作用，既促进益生菌的生长，又同时抑制致病菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能够应用在饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物等中能分泌纤维素酶并降解纤维素生产益生纤维寡糖的，且分泌抗菌肽多功能重组酿酒酵母。

本发明是通过将外切β-1,4-葡聚糖酶(Exo-β-1,4-glucanase，CBH)基因、内切β-1,4-葡聚糖酶(Endo-β-1,4-glucanase，EG)基因、β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，BGL)等纤维素降解相关基因的合理搭配，再结合抗菌肽(Antimicrobial peptide)基因，构建到酿酒酵母整合表达载体中，转入到酿酒酵母中，实现分泌表达，从而纤维素酶间的协同作用产生更多的纤维寡糖，分泌出的抗菌肽类具有抗菌活性，从而得到具有多功能益生重组酿酒酵母。

本发明的目的在于提供一种能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体及其构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种能降解纤维素生产益生纤维寡糖并分泌抗菌肽的多功能酿酒酵母及其构建方法。