[发明专利]结直肠癌易感基因变异文库构建方法

权利要求书

1.一种结直肠癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.根据结直肠癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对，所述引物对的5’端均引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基；

B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：

R=0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；

其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值，

将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；

C.将待测样品DNA抽提纯化；

D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物，采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度；

E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后进行纯化；

F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后进行纯化，得到测序文库。

2.根据权利要求1所述的结直肠癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述结直肠癌相关基因包括APC、BMPR1A 、CDH1、CHEK2、EPCAM 、MLH1、MSH2、MSH2、MUTYH、PMS2、C-met、PTEN、SMAD4、STK11、TP53、AXIN2、MLH3、BUB1、CYP1A2、MMP2中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的结直肠癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述引物对所覆盖的变异区域包括chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr5：112767236-112767252、chr5：112792503-112792252、chr5：112827956-112827986、chr5：112838873-112838928、chr5：112840654-112840677、chr17:65536321-65536383、chr17:65537388-65537406、chr17:65557986-65558000、chr17:65549523-65549581、chr10:86890071-86890091、chr10:86921583-86921623、chr2:110638014-110639101、chr2:110641182-110641198、chr2:110653457-110653493、chr2:110661715-110661778、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、ch2:47373517-47373532、ch2:47373921-47373956、ch2:47378954-47378980、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、hr7:116775003-116775102、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr14:75018901-75018935、chr14:75032111-75032150、chr14:75042427-75042446、chr14:75047713-75047731、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr18:51054783-51054797、chr18:51058154-51058204、chr18:51067085-51067078、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、ch10:97938720-ch10:94938771、ch10:94942196-ch10: 94942266、ch10:94949247-ch10:94949282、ch16:55484117-55484159、ch16:55485699-55485770、ch16:55488596-55488662、ch16:55489754-55489820中的一个或多个。