[发明专利]鉴定恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性的引物及方法

说明书

本发明公开了一种鉴定恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性的引物及方法，包括上游引物(如SEQ ID NO：1所示)和下游引物(如SEQ ID NO：2所示)。根据基因多态性区域特征，设计特定的引物，经PCR扩增得到包含保守区域和多态性区域的DNA片段，通过测序、分析，能够对Pfmspdbl2基因是否突变进行鉴定，进而区分出是野生型还是突变型。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及鉴定Pfmspdbl2基因多态性的引物及方法。

背景技术

疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒传播寄生虫病。据世界卫生组织统计，目前全球有102个国家和地区流行疟疾，约34亿人受威胁，每年约有2亿病例，近60万人死亡，其中恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)对人类造成的致死率最高。疟原虫生活史包含人和按蚊两个宿主，在人体内先后寄生于肝脏细胞和红细胞中，称为红内期和红外期。恶性疟原虫裂殖子入侵红细胞是疟疾感染并致病的关键性步骤，入侵红细胞相关的蛋白主要分布在裂殖子表膜和棒状体，微线体，致密颗粒等细胞器，通常具有裂殖体期特异性表达，确定相关入侵蛋白并阐明裂殖子入侵红细胞机制是阻断入侵的前提，更是防治疟疾的重要手段。裂殖子表膜蛋白(Merozoite surface protein，MSP)家族是参与疟原虫入侵红细胞的重要蛋白，被认为是红内期疫苗研究潜在的靶抗原，是当前疟疾研究的热点。

恶性疟原虫的基因分型是近年来国际上的研究热点。不同基因型的恶性疟原虫虫株可能与其致病性、抗原性及对药物的敏感性有一定的关系。MSP3家族成员MSPDBL2是恶性疟原虫入侵红细胞的重要蛋白，以Pfmspdbl2为标靶研制相关疫苗之前必须考虑并分析其基因多态性特点，评估其在不同地理区域和不同人群中的多态性变异水平十分重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种鉴定恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种鉴定恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性的方法。

本发明首先提取待测恶性疟原虫基因组DNA，然后通过对恶性疟原虫Pfmspdbl2基因进行PCR扩增，将所获得的扩增产物送测序，经序列比对后，得到多态性鉴定结果。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一个方面是提供了一对用于恶性疟原虫Pfmspdbl2基因PCR扩增的特异性引物，其序列为：

上游：5′-GCATTCGATATATGTAATAATTATTAT-3′(如SEQ ID NO：1所示)；

下游：5′-GCTTTATAAGAAACACATATCTAA-3′(如SEQ ID NO：2所示)。

本发明第二个方面提供了一种鉴定恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性的方法，包括如下步骤：

1)提取待测恶性疟原虫基因组DNA；

2)恶性疟原虫Pfmspdbl2基因序列的扩增(用PCR技术从含有目的基因的恶性疟原虫基因组DNA中获取恶性疟原虫Pfmspdbl2的DNA片段)；

3)分别将扩增产物送测序，经序列比对后，得到多态性鉴定结果。

步骤1)具体为：用打孔器将血滤纸片剪裁成直径约3cm的小片，3枚，放入1.5ml离心管中，按照试剂盒的操作手册，提取待测恶性疟原虫基因组DNA。

步骤2)具体为：以恶性疟原虫基因组DNA作为模板，设计SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增。所述PCR扩增的反应条件为98℃预变性3.0min，98℃变性10sec，55℃退火15sec，68℃延伸3.0min，35个循环；68℃延伸10min，最后保存于4℃。