[发明专利]一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法。

背景技术

蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科常涉及的分析内容，在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要的工作。但是，由于蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。

现有蛋白质的定量方法主要是基于液相色谱质谱联用方法，为了控制、降低由于检测过程中带来的误差，可以在样品制备、检测过程中，加入内标。对于质谱来说，最理想的内标为同位素标记的内标，因为内标与被测物的理化性质完全一样，可以用于评估和校正前处理、色谱分离和离子化环节的误差。在质谱分离中，内标和被测物有显著的分子量(质合比)的差异，不会产生相互干扰。

其中蛋白质组学中最常用的标记技术是基于多肽层面的，它的目标在于通过一次操作，能够对所有蛋白质酶解多肽进行标记，通过标记物的同位素形式不同，可以在质谱中将多种多肽/蛋白质进行区分，现有技术中在多肽层面的标记方法包括二甲基法、iTRAQ法、TMT法、ICAT法等，可参见图1。现有基于多肽层面的标记方法进行标记时，存在许多不足，例如第一，多肽层面的标记方法使得两个样品在酶解之后混合，酶解前(提取、净化、还原、烷基化)的所有误差均无法得到校正，降低检测结果的精确度。第二，虽然其中iTRAQ法、TMT法、ICAT法三者均已有商品化试剂，但是商品化的标记试剂约为1000～3000元/反应，价格昂贵。

蛋白质的同位素标记技术还包括SILAC技术，其中SILAC蛋白质的生产步骤主要分成两步：(1)将目标蛋白基因转入大肠杆菌中；(2)将大肠杆菌在同位素标记的培养液中培养，使其表达同位素标记的蛋白质。SILAC同位素蛋白质与目标蛋白质具有完全一致的一级结构，理化结构相近，可以在样品提取前加入SILAC蛋白质作为内标，用于校正样品处理、检测过程中的全过程误差。但是SILAC技术存在以下不足：(1)SILAC蛋白合成的价格昂贵，据SILAC合成企业的估价，大约10mg SILAC蛋白质需要20万欧元左右，大约满足数百到一千次样品的检测需求，折合每次检测200～400欧元左右；(2)SILAC蛋白质的生产基于转基因表达技术，由于现有技术限制，不是所有的蛋白质均能成功通过该技术表达出来；(3)正常表达的蛋白质在表达完成后，会进行表达后修饰和蛋白质折叠，而转基因表达的蛋白质不会进行这两个步骤，所以转基因表达的蛋白质在空间结构上与正常表达蛋白质有显著区别。

由上述可知，现有蛋白质的同位素标记技术依然存在价格昂贵，操作繁琐，操作过程中存在一定的误差等诸多不足。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，使得操作过程中产生的误差得以校正，而且操作方便，成本较低。

本发明的技术方案为：一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，包括以下步骤：

(1)采用化学标签A对待测样品进行标记，得到标记样品；

(2)采用带同位素标记的化学标签iso-A对内标物进行标记，得到标记内标物；

(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀，得到初样；

(4)对初样进行预处理，得到进样样品；

(5)将所述进样样品进行检测。

本发明中化学标签A与化学标签iso-A为相同的标记物质，化学标签iso-A与化学标签A的不同之处在于，化学标签iso-A与化学标签A上的其中一种或多种化学元素互为同位素。

本发明的标记方法基于蛋白质层面，本发明将待测样品和内标物分别采用化学标签A和带同位素标记的化学标签iso-A标记后，再将两者混合并置于同一反应体系下进行后续的处理工作，使得待测样品和内标物在同一体系中所受到的基质效应、操作误差均相同，使得误差可以得以校正。

天然蛋白质具有一定的空间结构，形成或疏或密的三维结构。作为优选，所述步骤(1)中采用化学标签A对待测样品进行标记之前，将待测样品进行蛋白质变性处理。经由蛋白质变性处理可以破坏蛋白质中固定其空间结构的键，使结构松散，可以使得化学标签结合位点暴露出来，让化学标签A易于接触到其结合位点，增加化学标签结合率。