[发明专利]一种马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的制备方法和应用

说明书

本发明公开了马流产沙门氏菌来源的鞭毛蛋白FliC的制备方法和其在马流产沙门氏菌病免疫中的可能应用。通过将马流产沙门氏菌来源的鞭毛蛋白FliC基因克隆并连接到原核表达载体pGEX‑4T‑2中，获得该蛋白的原核重组体,转化至工程菌BL‑21中并对该蛋白进行诱导表达及纯化，该蛋白具有序列表1中的氨基酸序列，纯化后的FliC重组蛋白免疫实验动物后具有良好的免疫原性，该FliC重组蛋白可克服灭活疫苗产生的抗体水平低和安全性不佳的缺点，可用于制备防治马副伤寒感染的亚单位疫苗和作为马属动物疫苗佐剂使用,具有良好的开发应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程和免疫技术领域，具体内容是马流产沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC及其编码氨基酸序列，涉及马流产沙门氏菌来源的FliC蛋白的制备方法和其在免疫中的可能应用。

背景技术

马流产沙门氏菌病又称马副伤寒，是由马流产沙门氏菌(Salmonella Abortusequi)引起的一种以孕马流产为特征的马属动物传染病，初产母马和幼驹对本病易感性最高，幼驹感染后多呈败血症或局部炎症，公畜则为睾丸炎与髯甲瘘(邢涛，2008)。该病是危害马匹的严重传染病之一，在马群中很难净化，随着易感马匹数量的增加，还会引起下一次的爆发，给养殖户造成严重经济损失。据报道母马由其引起的流产率可占马流产总数的30-60％，未感染区域传入本病则流产率可高达90％以上，本病常在地区的可出现70％的幼驹副伤寒。根据对新疆地区马匹马流产沙门氏菌的流行病学调查结果，母马由本病引起的流产率一般占马流产总数的40％～60％。随着马匹数量和各类专门化马匹新品种的增加，由该病引起的马流产越来越多,该病已造成严重经济损失，成为阻碍马业发展的重要原因之一。

目前疫苗是预防其感染的有效方法之一。目前临床治疗马流产沙门氏菌病的主要方法为抗生素疗法，但随着抗生素大量使用导致耐药菌株的产生，严重困扰该对病的治疗。目前一般采用灭活疫苗预防马流产沙门氏菌。国内外的报道表明,灭活疫苗的效果并不理想，用灭活疫苗预防过的马匹仍发生沙门氏菌流产,用减毒或无毒活疫苗免疫马匹，效果明显优于灭活疫苗。但是沙门氏菌血清型众多，易产生变异，因此非常有必要开展新型疫苗研发。

马流产沙门氏菌的鞭毛不仅具有运动性和趋化性，还是该菌的重要毒力因子和重要的免疫原。鞭毛可在细菌入侵宿主的过程中，对宿主细胞起黏附和侵袭作用。此外，研究表明鞭毛与Toll样受体5(toll-like receptor 5，TLR5)结合后活化TLR5，通过对信号通路的识别与激活，产生大量前炎症细胞因子如IL-8、TNF-α等，介导促炎性反应，使宿主获得先天或被动免疫应答。研究结果表明鞭毛蛋白在连接天然免疫应答和获得性免疫应答中起重要作用，可诱导机体产生天然免疫应答和获得性免疫应答。沙门氏菌的鞭毛蛋白作为该菌主要的抗原成分，可引起机体的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫(安芳兰等，2010)。当机体感染沙门氏菌时，这些鞭毛蛋白可诱导产生鞭毛特异性的CD4+/CD8+T细胞活化及相应的体液免疫反应(Bergman等，2005，Salerno-Goncalves等，2003)。

沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC被称为第一相鞭毛抗原，具有较高特异性，因FliC蛋白具有免疫性强、特异性高的特点，目前成为多种疫苗研究的热点。鞭毛作为疫苗研制的候选成分，有着其不可比拟的优点:低剂量发挥效用，预先存在的鞭毛蛋白抗体并不会引起佐剂活性的损伤，在C末端或者高变区插入抗原序列不会失去鞭毛蛋白激发TLR5的信号途径，给予小鼠或者家兔滴鼻注射免疫时无任何可检测的毒性，并且可以在药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice，GMP)条件下大量生产等。