[发明专利]一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法有效
| 申请号： | 201611199010.8 | 申请日： | 2016-12-22 |
| 公开（公告）号： | CN106755405B | 公开（公告）日： | 2019-11-01 |
| 发明（设计）人： | 严华兵;周慧文;谢向誉;曹升;尚小红;陈新;陆柳英;曾文丹 | 申请（专利权）人： | 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 重庆为信知识产权代理事务所(普通合伙) 50216 | 代理人： | 刘旭章 |
| 地址： | 530011 广西壮族自治区南宁市（里建*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 肉质 木薯块根 木薯 块根 基因组DNA 分子标记 种鉴定 分子标记辅助育种 分子标记分析 限制性内切酶 核苷酸序列 琼脂糖凝胶 大田移栽 电泳分离 电泳结果 快速选择 酶切产物 特异引物 颜色材料 颜色判定 育种进程 育种目标 育种效率 叶片DNA 抽提 可用 扩增 酶切 位点 叶片 鉴别 检测 | ||
1.一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列，设计一对特异引物可以扩增包含SNP2位点的260bp核苷酸序列，然后用该特异引物对木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)利用限制性内切酶AluI酶切步骤(1)得到的PCR扩增产物，获得酶切产物；
(3)使用浓度为3.0％琼脂糖凝胶对步骤(2)的酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯材料的块根肉质颜色判定，块根肉质颜色判定标准为：
若电泳后可见2条带——194bp和66bp，或电泳后见1条带——194bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为黄色；
若电泳后可见2条带——172bp和66bp，或电泳后见1条带——172bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为白色；
若是电泳后可见3条带——194bp、172bp和66bp，或电泳后见2条带——194bp和172bp，则该木薯材料的块根肉质颜色为浅黄色；
在步骤(1)，所述特异引物核苷酸序列为：
上游引物：5’GCTTCACACATAACGCCAACA-3’；
下游引物：5’TGGCTGAAACAGATGTTCAAAGG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法，其特征在于：在步骤(1)，所述PCR扩增的反应体系为25μL，由下列成分组成：10×PCRbuffer2.5μL、2μL浓度为25mmol/L的MgCl2、2μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs、0.5μL浓度为10μmol/L的正向引物、0.5μL浓度为10μmol/L的反向引物、0.5μL浓度为5U/μL的Taq、1μL浓度为50ng/μL的模板DNA。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法，其特征在于：在步骤(1)，所述PCR扩增的条件为：先在94℃下预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸10min，4℃下保存。
4.根据权利要求1所述的一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法，其特征在于：在步骤(2)，所述酶切体系为15μL，其中包含：PCR产物10μL、10×Lbuffer1.5μL、限制性内切酶AluI3.0U，其余为ddH2O。
5.根据权利要求1所述的一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法，其特征在于：在步骤(3)，所述电泳方法为：用3.0％琼脂糖凝胶电检测泳，缓冲液为0.5×TBE，上样量为15μL，在5V/cm恒压下电泳1.5h。
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