[发明专利]一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种快速检测脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒的使用方法，该试剂盒包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液；

所述的脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体；

所述的磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体；

所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：

（1）取磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL 三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在60℃水浴中振荡反应1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3 min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90~100nm，得到内部包裹有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的脂质体，其中，磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为10:8:2:0.6；三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液为溶于二甲基甲酰胺中质量浓度为3%的溶液；

（2）取50μL浓度为1x10^-10 mol/L的链霉亲和素与500μL步骤（1）制得的脂质体，混合，在室温下孵育1h，制得表面包被有链霉亲和素的脂质体；

（3）往步骤（2）制得的脂质体中加入生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12 h，加入2%(w/v)BSA，继续孵育12 h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得脂质体复合物；

所述的步骤（3）中生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的制备包括以下步骤：取抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0~2.0mg/mL的溶液；另取EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS 缓冲液中，制成浓度为10~20mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0~2.0mg/mL 的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶液与25μL的浓度为10~20mM的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1~2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体；

所述的磁性分离试剂的制备包括以下步骤：

取1mL生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与200µg的链霉亲和素包被的磁微粒混合，在室温条件下，100r/min 反应1~2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2~0.4mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体结合的链霉亲和素位点，反应结束后，磁性分离，去上清，用pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次以除去多余的D-生物素，加入含2% (w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐温-20、pH为7.2的 PBS溶液复溶，即得磁性分离试剂；

所述的链霉亲和素包被的磁微粒的制备包括以下步骤：

（1）取1mg氨基末端磁性微粒，加入400μL甲醇反复清洗，磁性分离，弃上清，加入400μL的交联剂溶液，置于恒温振荡器，反应10h，然后依次用甲醇和超纯水将反应后的磁性微粒反复清洗多次，保存于水中备用；其中，交联剂溶液的制备包括以下步骤：取50mg的碳化二亚胺和50mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合，加入100ml的PBS缓冲溶液溶解，即得；

（2）将步骤（1）制得的磁性微粒用500μL PBS缓冲溶液平衡30~60min，加入200 µg 链霉亲和素，置于恒温振荡器中反应1~2h，磁性分离去上清，用含1mmol/L EDTA的PBS缓冲溶液反复清洗，制得链霉亲和素包被的磁性微粒；

所述的标准品的制备包括以下步骤：

使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2% (w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为 0，50，100，250，500，1000ng/ml 的标准液，即得；

所述的质控品的制备包括以下步骤：使用含0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、2%(w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐温-20的溶液将脂蛋白相关磷脂酶A2抗原配制成浓度分别为300，700ng/ml 的溶液，即得；

所述的分析缓冲液的组成为：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氢钾、0.1mol/L氯化钠、0.1% (v/v) 吐温-20、1% (v/v) Triton X-100，pH为7.0~7.2；

所述的清洗液为含0.1% (v/v) 吐温-20、0.1mol/L氯化钠，且浓度为0.05mol/L、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液；

所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）使用含2%(w/v) BSA的PBS缓冲液将脂质体复合物按1:5的比例进行稀释；

（2）取25μL稀释后的脂质体复合物、25μL磁性分离试剂、50μL待测样本或脂蛋白相关磷脂酶A2标准品，混合，在室温条件下涡旋1h，充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物，将反应液吸入电化学反应池中，所述的磁性微粒-抗原-脂质体复合物通过磁性吸附于电极表面，加入100μL清洗液轻轻润洗电极表面3次，去清洗液，然后加入500μL反应缓冲液，使脂质体内的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶出，溶出的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯上的酰基与链霉亲和素上的氨基发生偶联反应，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，与抗体结合，电化学工作站通电，启动ECL反应，通过光电倍增管收集电化学发光信号；

（3）测定梯度浓度的脂蛋白相关磷脂酶A2标准液的发光强度变化值，根据发光强度变化值对数与相应的浓度对数绘制反应曲线，计算待测样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度。