[发明专利]一种快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法

说明书

一.技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及应用液相色谱串联质谱法快速测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法。

二.背景技术

霉菌毒素是一类由丝状真菌的次生代谢产物构成的毒性物质，由于它对人体的毒害性且近年来在食品和植物种子中频繁检出而引起世界的广泛关注。在农作物生长过程及后续储藏运输过程中，镰刀霉菌、麦角菌、曲霉菌、青霉菌及链格孢菌都可能产生霉菌毒素，而其中镰刀霉菌产生的毒素最为流行，在美洲、欧洲及亚洲农产品中普遍存在。

镰刀霉菌类至少包含100种以上的植物病菌，他们产生的毒素多数化学性质稳定，易残留于最终加工食品中，如我们熟知的脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)及伏马毒素(fumonisins)。国家标准《安全国家标准食品中真菌毒素限量》(GB2761-2011)虽对部分已知毒素的限量做了规定，但还远不能满足当前食品安全监管的需求。近年来，随着研究的不断深入，新兴的镰刀霉菌毒素(Emerging Fusarium Mycotoxins)不断被发现，其中最引人关注的为4种恩镰孢菌素(enniatin)A、A1、B、B1，以及白僵菌毒素(beauvericin)。文献资料表明这些物质均有不同的毒性，有些毒性甚至超过先前发现的其他毒素，且可能与其他毒素产生协同毒害作用。有国外学者曾对全球多个国家和地区的粮食进行该类毒素的筛查，发现潮湿气候的地区粮食中新兴镰刀霉菌毒素的检出率非常高。我国南方地区温暖潮湿，粮谷储存不当极易引起霉菌滋生，产生毒素。而到目前为止，国内并无公开的该类毒素的检测方法，更没有学者对国内生产的粮食作物及其深加工产品中的新兴镰刀霉菌毒素开展食品安全风险预警评估工作。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是采用串联液相色谱质谱联用法准确测定粮谷中镰刀霉菌毒素的方法。这5种镰刀霉菌毒素分别为恩镰孢菌素A、A1、B、B1，以及白僵菌毒素(以下简称ENA、ENA1、ENB、ENB1、BEA)。

本发明技术原理

首先，如何从粮谷中快速有效的将这5种真菌毒素快速提取出来，同时最大限度减低基质干扰。经过大量的试验筛选，本发明最终选择纯乙腈作为样品的提取溶剂，考虑到5种真菌毒素均为大分子低极性化合物，在乙腈溶液中的溶解性较好，且作为最终上机测试的溶液，与液相色谱流动相体系的兼容性较好，不需要做溶剂置换，造成损失。此外，因后续需要用C₁₈粉末吸附掉样品中的脂肪、色素及其他亲脂性杂质，选择这种比例的混合溶剂，可以最大限度的保留待测目标物，减少其在吸附剂上的死吸附，提高实验回收率。本发明中的前处理方法采用采用微波辅助分散固相萃取技术(microwave-assisted extraction，MAE-QuEChERS)，这样的前处理步骤实践证明其简单快速，而且成本低廉，非常适合在各个食品安全检测实验室推广应用。

其次，如何选择最优的色谱及质谱条件，使得在尽可能短的时间内对样品中的5种真菌毒素进行同时的分析，并产生最高的灵敏度。近年来，液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)在检测毒素的优势得到体现，因其采用选择离子监测技术.可大大提高检测的灵敏度和特异性，因此可以采用比传统方法更为简便的前处理技术，是同时检测多种毒素的理想方法。本发明在对5种真菌毒素的化学性质进行详细了解的前提下，不断优化仪器条件，最终选定的液相条件为采用流动相A为水，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min，流动相梯度洗脱程序为：B在5min内由20％线性升至80％，再于1min后回到20％，保持2min，选择离子丰度最高的子离子作为定量离子，选择丰度次高的子离子作为定性离子，使用外标法定量。

本发明的技术方案：

1.质谱参数的选择

所研究的目标物为真菌毒素，基于其化学结构属于离子载体型，易形成单价或二价态的离子。文献表明，流动相中提供的钠离子和氢离子易与目标物结合，形成[M+Na]⁺或者[M+H]⁺离子，当然如果我们额外加入铵盐，铵根离子则可能替换上述两种离子，成为最关键的待测离子。但实验表明，[M+NH₄]⁺的稳定性却不如[M+Na]⁺或者[M+H]⁺离子，后两者中，[M+H]⁺的响应值高于加钠离子，所以最终选择[M+H]⁺作为待监测的母离子。