[发明专利]一种腈水解酶及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种腈水解酶及其应用，所述腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明提供的腈水解酶可在12h反应时间里，共将600mM的底物完全水解，由于底物流加和pH调控的稀释作用，累计产生了112g/L的产物邻氯扁桃酸。整个反应过程中反应转化率保持在90％以上。反应10h后停止流加，继续反应2h后底物全部转化完。反应速率非常快，反应转化率也很高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种腈水解酶及其应用。

背景技术

(R)-(-)-邻氯扁桃酸是一种具有广泛用途的医药中间体和精细化工品，主要用于抗血小板凝集药物氯吡格雷的合成。氯吡格雷作为全球重磅级药物，2010年全球销售额近100亿美元，2011和2012年的销售额也都在90亿美元以上。随着2012年5月17号氯吡格雷专利到期，全球掀起了一股仿制热潮。而作为其重要中间体的(R)-(-)-邻氯扁桃酸随之也水涨船高，国内外需求不断增长，因此研究如何获得高浓度、高纯度的(R)-(-)-邻氯扁桃酸将具有重要的市场意义。

国内外通过腈水解酶酶法制备(R)-(-)-邻氯扁桃酸已有报道，但数量不多。张陈胜通过传统的基因组探矿技术从Stappiaaggregata中筛选到对邻氯扁桃腈具有对映体选择性的腈水解酶LaN，产物(R)-(-)-邻氯扁桃酸的ee值为96.5％，但活力不高。BASF公司构建了来源于A.faecalis ATCC 8750的腈水解酶Y296位的不同突变体，其中Y296A突变体对外消旋的邻氯扁桃腈的相对比活力为Y296野生型的近10倍。Y296C突变体对所检测的每一个取代的扁桃腈都具有相当高的活力，而对于未发生取代的扁桃腈活力则没有改变。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的重组腈水解酶，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种腈水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

如上所述的腈水解酶在催化合成R-邻氯扁桃酸中的应用。

如上所述的腈水解酶在催化合成R-邻氯扁桃酸的中间产物中的应用。

本发明以源于Bradyrhizobiumjaponicum USDA110的腈水解酶(bll6402，NP_773042)氨基酸序列为模板进行改造，获得的新型重组腈水解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明可推动腈水解酶在手性医药中间体合成中的应用，极大降低R-邻氯扁桃酸的生产成本，进而降低氯吡格雷的价格，具有很好的示范作用，将会产生良好的社会效益与经济效益。而通过生物催化法的温和反应条件将显著降低能耗及三废排放量。项目的顺利实施不仅可以实现R-邻氯扁桃酸的绿色生产，还可以为建立以腈水解酶为基础的生物催化法制备手性药物中间体等手性化合物的技术平台提供技术支撑，能够提高我国的生物、化工、医药等领域的手性药物、手性食品添加剂和手性农药及其中间体等的研发水平，有利于我国的绿色生产、工业生物技术的发展，有着广阔的应用前景，对国民经济的可持续发展具有重要意义。

本发明还请求保护编码权利要求1所述的腈水解酶的基因。

优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

需要注意的是，本领域技术人员可根据本发明提供的腈水解酶的氨基酸，根据密码子的简并性原则等自行调整其核苷酸序列以及功能等价体，这些经过调整的序列也在本发明请求保护的范围内。

此外，本发明还请求保护在严格条件下能够与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；以及与上述序列互补的核苷酸序列。